一种亲和力成熟的抗喹硫磷纳米抗体及其应用

1.本发明属于抗体工程技术领域。更具体地，涉及一种亲和力成熟的抗喹硫磷纳米抗体及其应用。


背景技术：

2.喹硫磷，是一种有机磷农药，化学式为c
12h15
n2o3ps，为无色结晶性粉末，为广谱性杀虫、杀螨剂，具胃毒和触杀作用，无内吸和熏蒸作用，有一定的杀卵作用。广泛应用在棉花、水稻、果树、蔬菜等作物上防治多种害虫，包括瘿蚊、稻纵卷叶螟、棉铃虫、柑橘潜叶蛾、小绿叶蝉、菜青虫等。目前，国内外关于喹硫磷降解特性研究多集中于水解和光解，喹硫磷属中毒性杀虫剂，在环境中不易降解。喹硫磷在农业生产上广泛使用，导致了农作物中发生不同程度的残留，对人体的危害以急性毒性为主，多发生于大剂量或反复接触之后，会出现一系列神经中毒症状，如出汗、震颤、精神错乱、语言失常，严重者会出现呼吸麻痹，甚至死亡。
3.免疫分析技术是目前农兽药残留快速检测中应用最普遍的技术，也是国内外的研究热点。然而，现有的免疫检测技术在灵敏度、特异性等方面还无法满足所有实际检测需求，单克隆抗体的不稳定、不易量产等缺点也限制了相关免疫分析技术的进一步发展。纳米抗体是新一代的基因工程抗体片段，它来源于骆驼科动物的重链抗体。重链抗体(heavy-chain antibody，hcabs)，是只含有重链而缺少轻链的抗体，是hamers-casterman等1993年在分离单峰驼血清时所发现。后来人们通过基因工程技术表达出这种重链抗体的抗原结合区，其分子量大小只有15kd左右，仅为传统抗体的十分之一左右，是目前通过基因工程手段制备出的具有抗原识别与结合能力的最小抗体片段，其尺寸处于纳米级别，故又称为“纳米抗体”。
4.在纳米抗体的研究过程中，人们发现纳米抗体具有一些有别于传统抗体的性质，其中最典型的是纳米抗体的稳定性强，能够在高温处理后以及在一定浓度的有机溶液中仍保留着较高的抗原结合能力，这些性质对于抗体的实际应用具有重要意义，使得基于纳米抗体的免疫分析法更加能满足市场对快速检测的需求。而目前未见能应用于检测喹硫磷的高灵敏度的纳米抗体，为了满足实际检测需求，有必要研发出更多更加灵敏的能够用于喹硫磷的检测的抗体，对于实际生产应用具有实用意义。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服上述的缺陷和不足，提供一种亲和力成熟的抗喹硫磷纳米抗体及其应用。
6.本发明的第一个目的是提供一种亲和力成熟的抗喹硫磷的纳米抗体。
7.本发明的第二个目的是提供编码所述亲和力成熟的抗喹硫磷纳米抗体的核苷酸。
8.本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
9.本发明的第四个目的是提供一种重组细胞。
10.本发明的第五个目的是提供所述纳米抗体、所述核苷酸、所述重组载体或所述重组细胞的应用。
11.本发明的第六个目的是提供一种检测喹硫磷农药的酶联免疫分析方法。
12.本发明的第七个目的是提供一种检测喹硫磷的试剂盒。
13.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
14.本发明在抗喹硫磷纳米抗体8f(其氨基酸序列为evqlqqsggdsvqaggslrlscvasgrayciydvtwyrqapgkerefvsfidtndrktyadsvegrftisqdkpsatvhlqmntlkpedtamyyckasvtwpcrpatywgqgtlvtvss)的基础上，进行同源模建及分子对接，确定纳米抗体与喹硫的关键识别位点，采用定点饱和突变技术构建抗体突变库，并进一步通过噬菌体展示及生物淘筛技术对抗喹硫磷纳米抗体8f进行了亲和力成熟，获得了一种对喹硫磷亲和力相较野生型纳米抗体(8f)更高的纳米抗体m1-7e，其氨基酸序列如seq id no.1所示，编码亲和力成熟的特异性识别喹硫磷纳米抗体的核苷酸序列如seq id no.2所示。
15.本发明提供一种重组载体，含所述编码亲和力成熟的抗喹硫磷纳米抗体的核苷酸序列seq id no.2。
16.本发明提供一种重组细胞，含所述的重组载体。
17.本发明提供所述纳米抗体、所述核苷酸、所述重组载体或所述重组细胞在喹硫磷农药检测或制备检测喹硫磷农药试剂盒中的应用。
18.本发明提供一种检测喹硫磷农药的酶联免疫分析方法，采用所述亲和力成熟的特异性识别喹硫磷的纳米抗体，以喹硫磷人工抗原为包被原，进行酶联免疫检测。
19.优选地，所述酶联免疫为间接酶联免疫检测。
20.更优选地，所述喹硫磷人工抗原为h1-ova，其结构式如下所示：
[0021][0022]
具体检测方法为：
[0023]
s1.制备包被含喹硫磷农药完全抗原的酶标板；
[0024]
s2.将喹硫磷农药标准品或待测样品加入酶标板微孔中，然后加入所述纳米抗体；
[0025]
s3.加入酶标记的二抗，孵育；
[0026]
s4.加入显色液，孵育；
[0027]
s5.加入终止液并测定；
[0028]
s6.以药物标准浓度的log
10
值为横坐标，以各标准品浓度的吸光值与零标准孔吸光值的比值为纵坐标，建立标准曲线，进而根据待测样品的吸光值来计算待测样品中的喹硫磷农药的含量。
[0029]
将本发明提供的纳米抗体用于检测喹硫磷农药的酶联免疫分析方法中，能够检测喹硫磷农药，ic
50
为18.62ng/ml，最低检测限为1.93ng/ml，线性范围为5.14-67.45ng/ml，该方法的检测结果准确、效果好、稳定性好。
[0030]
本发明提供一种检测喹硫磷的试剂盒，包含所述亲和力成熟的特异性识别喹硫磷的纳米抗体。
[0031]
本发明采用亲和力成熟的纳米抗体的获得方法，在一种抗喹硫磷纳米抗体的基础上，进行同源模建及分子对接，确定纳米抗体与喹硫的关键识别位点，采用定点饱和突变技术构建抗体突变库，并进一步通过噬菌体展示及生物淘筛技术对抗喹硫磷纳米抗体进行了亲和力成熟，获得一种突变纳米抗体m1-7e。
[0032]
优选地，所述抗喹硫磷的纳米抗体8f的氨基酸序为evqlqqsggdsvqaggslrlscvasgrayciydvtwyrqapgkerefvsfidtndrktyadsvegrftisqdkpsatvhlqmntlkpedtamyyckasvtwpcrpatywgqgtlvtvss。
[0033]
优选地，所述关键识别位点为gly26、arg27、ser98。
[0034]
本发明具有以下有益效果：
[0035]
本发明对抗喹硫磷纳米抗体8f进行了亲和力成熟，获得了一种对喹硫磷亲和力相较野生型纳米抗体(8f)更高的纳米抗体，其氨基酸序列如seq id no.1所示，该纳米抗体能够特异性识别喹硫磷农药，相比原来的纳米抗体灵敏度提高了18％，最低检测限降低了25％；将本发明提供的纳米抗体用于检测喹硫磷农药的酶联免疫分析方法中，能够检测喹硫磷农药，ic
50
为18.62ng/ml，最低检测限为1.93ng/ml，线性范围为5.14-67.45ng/ml，该方法的检测结果准确、效果好、稳定性好，可以更加广泛的应用于农产品中喹硫磷农药残留的检测。
附图说明
[0036]
图1为纳米抗体8f的三维模型；
[0037]
图2为纳米抗体8f同源建模型的拉式图；
[0038]
图3为纳米抗体8f同源模型的errat图；
[0039]
图4为纳米抗体8f同源模型的verify3d图；
[0040]
图5纳米抗体8f与喹硫磷的相互作用三维模型(a)及相互作用二维图(b)；
[0041]
图6为纳米抗体8f饱和突变实验方案；
[0042]
图7为ic-elisa鉴定阳性突变体克隆；
[0043]
图8为纳米抗体m1-7e和8f检测喹硫磷标准曲线。
具体实施方式
[0044]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0045]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0046]
实施例1抗喹硫磷纳米抗体的同源建模及分子对接
[0047]
1、抗喹硫磷纳米抗体的同源模建及模型评价
[0048]
采用本发明人实验室研究获得的抗对硫磷纳米抗体vhh9的晶体结构为模板，将抗喹硫磷纳米抗体8f的氨基酸序列(evqlqqsggdsvqaggslrlscvasgrayciydvtwyrqapgkerefvsfidtndrktyadsvegrftisqdkpsatvhlqmntlkpedtamyyckasvtwpcrpatywgqgtlvtvss)上传至swiss-model在线服务器，经过筛选，最终得到一个得分最高的模型，如图1所示，其中绿色代表fr区，黄色代表cdr1区，蓝色代表cdr2区，红色代表cdr3区。为了进一步验证模型的
可靠性，分别通过拉式图的氨基酸二面角以及errat和verify 3d指标对同源模型进行评价。
[0049]
其中，拉式图可用于分析模型的骨架结构及构象是否合理，其结果显示了模型氨基酸的分区情况，主要分为4个区域：核心区域、额外允许区、大致允许区以及禁阻区。拉式图结果如图2所示，95.1％氨基酸落在核心区域，且100％氨基酸位于有利位置，根据拉式图评分标准(大于90％氨基酸落在核心区域)，可以认为纳米抗体8f同源模型是可靠的。
[0050]
errat指标通过结晶学评估模型的三维结构，表明0.35nm范围之内，不同原子类型对之间形成的非键相互作用的数目(侧链)，理论上得分大于85分说明模型是可靠的，而纳米抗体8f的同源模型得分为88.889，如图3所示，符合要求。用verify3d模块对模型的三维结构与任一氨基酸序列的兼容性进行打分，其结果如图4所示，纳米抗体8f的同源模型中100％残基的3d-1d分值≥0.2，超过80％的合格线，说明模型是可靠的。综上，最终得到的模型是可靠的，可用于后续研究。
[0051]
2、纳米抗体8f与喹硫磷药物的分子对接
[0052]
经模型评估后，将纳米抗体8f的三维模型与喹硫磷的结构输入discovery studio软件中cdocker模块进行半柔性对接，选取评分最高的对接模型，即结合自由能最低的对接模型，如图5所示。
[0053]
通过分析对接结果，我们可以发现纳米抗体8f与喹硫磷之间的相互作用主要为氢键作用跟疏水相互作用。相互作用口袋涉及的残基包括val2、leu4、ala24、gly26、arg27、cys30、ile31、val34、ala97、ser98、val99、cys103、arg104，这些残基主要来源于fr1区，cdr1区和cdr3区，表明纳米抗体8f的结合口袋主要是由fr1区，cdr1区和cdr3区组成。其中，gly26与喹硫磷上的3号位o原子形成氢键，键长为ser98和arg27分别与喹硫磷上的21位、27位h原子形成氢键，键长分别为与gly26、ser98和arg27均位于纳米抗体8f的cdr区，表明这三个氨基酸残基可能是纳米抗体8f识别喹硫磷药物分子的关键位点。
[0054]
实施例2点饱和突变文库的构建
[0055]
根据上述分子对接及丙氨酸扫描实验结果，对gly26、arg27和ser98三个位点的氨基酸进行定点饱和突变，突变方案如图6，构建饱和突变库。
[0056]
进行饱和突变的引物序列如下表1所示，首先用引物gly26arg27-f及ser98-r扩增片段1，扩增反应条件为：95℃，30s；95℃，15s，55℃，15s，72℃，30s，30个循环；72℃，10min；接着用引物gly26arg27-r及ser98-f扩增片段2，扩增反应条件为：95℃，30s；95℃，15s，65℃，15s，72℃，4min，30个循环；72℃，10min。
[0057]
表1饱和突变引物序列表
[0058][0059]
注：斜体为突变位点，其中n＝a/c/g/t，k＝g/t。
[0060]
反应结束后取少量pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若目的条带正确且单一，在同源重组之前进行dpnⅰ消化，去除甲基化模板质粒。经同源重组后，将连接产物转化进e.coli tg1中，通过稀释涂板计算饱和突变文库库容，并随机挑取克隆进行测序验证多样性。将培养基上的克隆用lb培养基刮下，加甘油调至20％浓度后分装于1.5ml离心管，置于-80℃冻存，即为抗喹硫磷农药vhh抗体饱和突变基因菌库。
[0061]
取上述突变库菌库1ml接种至200ml的lb中(含200μg/ml氨苄青霉素)，37℃，220rpm/min，培养至od
600
约0.5。按感染复数比20：1加入辅助噬菌体m13k07静置侵染30min，然后37℃，220rpm/min，1h，之后加入卡那霉素(50μg/ml)，过夜培养。次日，以12000rpm/min，离心20min，取上清，加入1/5的20％peg-nacl溶液，冰上孵育2h或4℃过夜。随后，12000rpm/min，离心20min，用pbs重悬噬菌体，即得到抗喹硫磷农药噬菌体展示纳米抗体突变库，吸取10μl测定抗体库的滴度，其余保存于-80℃备用。
[0062]
实施例3抗喹硫磷纳米抗体突变体的淘筛与鉴定
[0063]
采用本发明研究实验室前期合成的半抗原h1与卵清白蛋白ova(albumin)通过活泼酯法偶联制备出完全抗原h1-ova，其结构式如下所示：
[0064][0065]
以h1-ova为包被原，对实施例2中建立的纳米抗体突变文库进行亲和淘筛，共进行4轮，淘筛方案如下表2所示。
[0066]
表2点饱和突变文库淘筛方案
[0067][0068]
(1)包板：用pbs稀释包被原至1μg/ml。每轮包被3个去背景孔(klh、bsa及ova，1mg/ml，100μl/孔)和包被原孔(100μl/孔)，37℃中孵育过夜。次日，用pbst缓冲液洗板2次，每孔加入120μl封闭液，于37℃中孵育3h。弃去封闭液，37℃中烘干1h，于4℃冰箱中保存备用。
[0069]
(2)淘筛：取100μl纳米抗体文库加入到去背景孔，37℃中孵育1h。随后将液体转移至包被原孔，37℃中孵育1h。弃去包被原孔中液体，用pbst缓冲液洗涤5次，pbs缓冲液洗涤15次。第一轮采用酸洗脱，加入100μl 0.1m gly-hcl(ph 2.2)，37℃中孵育15min，吸出液体，立即加入50μl 1m tris-hcl(ph 8.0)中和。其余三轮采用竞争洗脱，加入100μl梯度稀释的喹硫磷溶液，37℃中孵育1h。取10μl洗脱产物通过平板菌落数计算滴度，其余洗脱产物经辅助噬菌体救援扩增后用于下一轮淘筛。
[0070]
(3)特异性噬菌体克隆的挑选与鉴定：随机挑取96个噬菌体克隆，接种到含500μl/孔lb培养基(amp)的深孔板中，37℃，180rpm震荡培养过夜。取20μl过夜菌接种到1ml/孔培养基(amp)深孔板中，37℃，180rpm震荡培养3h，每孔加入终浓度为1mm iptg，28℃180rpm震荡培养过夜。次日，4500rpm离心20min，弃去上清，置于-80℃超低温冰箱中3h。室温解冻后，沉淀用200μl pbs缓冲液重悬，将深孔板置于4℃中振摇1h。4500rpm离心20min，取上清进行ic-elisa检测。
[0071]
(4)ic-elisa检测具体步骤如下：
[0072]
1)包板：用包被液将包被原h1-ova稀释至1μg/ml，每孔加入100μl稀释后的包被原，于37℃恒温箱中孵育12-14h。
[0073]
2)封闭：次日，每孔用pbst缓冲液洗涤2次，拍干孔中液体，每孔加入120μl 2％脱脂奶粉，于37℃恒温箱中封闭2h。用pbst缓冲液洗涤2次，拍干备用。
[0074]
3)孵育一抗：每孔加入50μl周质蛋白和50μl pbs缓冲液，此为效价孔。每孔加入50μl上清液和50μl浓度为1μg/ml的喹硫磷溶液，此为抑制孔。37℃恒温箱中孵育40min后，用pbst缓冲液洗涤5次，拍干。
[0075]
4)孵育二抗：每孔加入100μl兔抗vhh-hrp二抗(5000倍稀释)，于37℃恒温箱中孵
67.45ng/ml，该方法的检测结果准确、效果好、稳定性好，可以更加广泛的应用于农产品中喹硫磷农药残留的检测。
[0093]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。