纳米抗体S43的构建体及其应用

本发明涉及生物医药领域，具体涉及纳米抗体s43的构建体及其应用，更具体地，涉及基于特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体s43的多价纳米抗体、纳米抗体融合 蛋白、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载 体、包含上述多核苷酸、核酸构建体或表达载体的转化的细胞以及包含上述任一项产品 的药物组合物及其在制备用于预防或治疗新型冠状病毒的药物中的应用、在制备用于检 测新型冠状病毒或诊断新型冠状病毒感染的试剂或试剂盒中的应用。

背景技术：

1、由冠状病毒科(family coronaviridae)的新型冠状病毒(sars-cov-2)引起的疫情在 全球范围内仍不断蔓延。除此之外，同属冠状病毒科的严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)等也是针对人类呼吸系统的主要病 原体，主要通过飞沫、气溶胶和接触等方式传播，其传染性强。

2、当前的新冠肺炎疫情暴发推动了各种疫苗和抗病毒药物的开发，其中接种疫苗可有效预防严重传染疾病的发生，但是疫苗的适用对象为未感染人群，且研发周期长，临 床研究过程复杂。而对于确诊患者而言，只能通过抗病毒药物进行治疗，其中一种抗病 毒药物是治疗性抗体药物，主要指中和抗体；中和抗体药物主要是通过与病原微生物表 面的抗原结合，阻止病原微生物表达的特定分子与细胞表面受体结合，达到“中和”的 效果。sars-cov-2病毒表面具有糖基化的刺突蛋白(spike protein,s)，该s蛋白能与宿主 细胞受体蛋白ace2相互作用并触发膜融合，因此阻断s蛋白与ace2的结合是治疗新冠 病毒感染的有效途径。

3、常规单克隆抗体，一般通过静脉注射给药，然而，通过静脉注射途径给药的单克隆抗体从全身循环进入肺部的药物浓度非常低，大大降低了中和抗体本身的抗病毒效果， 导致不能有效降低肺部的病毒载量。新型冠状病毒最初感染上呼吸道，它与免疫系统的 第一次相互作用主要发生在呼吸道黏膜表面，鉴于此，对于通过呼吸道感染的新冠病毒 而言，在关注血清抗体的同时，还有必要从黏膜免疫的角度去思考、设计和开发合适的 抗体类药物。例如，雾化给药可使抗体药物在呼吸道内达到更高的局部浓度，能在病毒 入侵时更有效地阻断病毒感染。

4、纳米抗体作为治疗性药物已备受关注，例如，由ablynx公司研发的纳米抗体药物caplacizumab(cablivitm)用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜，是首个获批上市的纳米抗体药物；再如，纳米抗体候选药物alx-0171是一种用于治疗小儿呼吸道合胞病 毒(rsv)感染的三价形式的纳米抗体，采用雾化给药，已进入临床ⅱ期阶段 (https://clinicaltrials.gov)，这些都提示：纳米抗体药物具有安全性、可行性。

5、因此，开发针对新型冠状病毒的、适于呼吸道黏膜免疫的纳米抗体药物具有潜在的临床应用价值与前景。

技术实现思路

1、发明目的

2、本发明的目的在于提供基于特异性结合sars-cov-2 rbd的纳米抗体s43的构建体(包括多价纳米抗体和纳米抗体融合蛋白)、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸 构建体、包含该核酸构建体的表达载体、包含上述多核苷酸、核酸构建体或表达载体的 转化的细胞以及包含上述任一项产品的药物组合物及其在制备用于预防或治疗新型冠 状病毒的药物中的应用、在制备用于检测新型冠状病毒或诊断新型冠状病毒感染的试剂 或试剂盒中的应用。

3、本发明的基于特异性结合sars-cov-2 rbd的纳米抗体s43的构建体(包括多价纳米抗体和纳米抗体融合蛋白)，能有效抑制sars-cov-2感染及其变异毒株感染，可以 雾化给药，能直达肺部，起效较快且半衰期长，为新冠病毒及其变异株感染提供了更有 效的治疗策略。

4、解决方案

5、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

6、第一方面，本发明提供了一种多价纳米抗体，其包括两条以上、特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体的vhh链，其中，所述特异性结合sars-cov-2 rbd的纳米抗体 的vhh链包括以下cdr：

7、氨基酸序列如seq id no:1(即，gftldyyaig)所示的cdr1，

8、氨基酸序列如seq id no:2(即，cissnnstyyadsvkg)所示的cdr2，以及

9、氨基酸序列如seq id no:3(即，epdysgvyyytcgwtdfgs)所示的cdr3。 在具体实施方案中，所述特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体的vhh链还包括4个框架区fr1-4，所述fr1-4与所述cdr1、cdr2和cdr3按顺序交错排列；

10、优选地，所述fr1-4的氨基酸序列分别如seq id no:4(即，qvqlqesggglvqpggslrltcaps)、seq id no:5(即，wfrqapgkeregvs)、 seq id no:6(即，rftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaa)和seq id no:7 (即，wgqgtqvtvss)所示。

11、在优选的具体实施方案中，所述特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体的vhh 链具有如seq id no:8所示的氨基酸序列，或与seq id no:8所示的氨基酸序列具有 至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列；优选地，所述vhh链的 氨基酸序列如以下seq id no:8所示：其中，下划线部分分别为框架区fr1-4，标黑部分分别 为重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3。

12、在优选的具体实施方案i中，所述多价纳米抗体由两条以上、优选地三条所述特异性 结合sars-cov-2rbd的纳米抗体的vhh链通过linker连接构成；

13、其中，所述linker为(ggggs)n，其中，n＝1,2,3,或4，优选地，n＝2或3。

14、作为具体实施方案i的进一步优选，所述多价纳米抗体为三价纳米抗体，具有如seq id no:9所示的氨基酸序列：

15、qvqlqesggglvqpggslrltcapsgftldyyaigwfrqapgkeregvscissnn styyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaaepdysgvyyytcgw tdfgswgqgtqvtvssggggsggggsggggsggggsggggsqvqlqesggglvqp ggslrltcapsgftldyyaigwfrqapgkeregvscissnnstyyadsvkgrftisrd nakntvylqmnslkpedtavyycaaepdysgvyyytcgwtdfgswgqgtqvtvss ggggsggggsggggsggggsggggsqvqlqesggglvqpggslrltcapsgftldy yaigwfrqapgkeregvscissnnstyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpe dtavyycaaepdysgvyyytcgwtdfgswgqgtqvtvss(seq id no:9)。

16、在优选的具体实施方案ii中，所述多价纳米抗体为由以下融合蛋白形成的igm五聚 体，所述融合蛋白从n端到c端的结构如式(i)所示：

17、a-l-b  (i)

18、其中，

19、a为单条、所述特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体的vhh链，或者为如上述 优选的具体实施方案i中所述的多价纳米抗体；

20、b为人源igm的fc片段；优选地，所述人源igm的fc片段具有如seq id no:10(即，viaelppkvsvfvpprdgffgnprksklicqatgfsprqiqvswlregkqvgsgvttd qvqaeakesgpttykvtstltikesdwlgqsmftcrvdhrgltfqqnassmcvpdqd tairvfaippsfasifltkstkltclvtdlttydsvtiswtrqngeavkthtniseshpna tfsavgeasiceddwnsgerftctvthtdlpsplkqtisrpkgvalhrpdvyllppare qlnlresatitclvtgfspadvfvqwmqrgqplspekyvtsapmpepqapgryfahsi ltvseeewntgetytcvvahealpnrvtertvdkstgkptlynvslvmsdtagtcy) 所示的氨基酸序列，或与seqid no:10所示的氨基酸序列具有至少95％，96％，97％， 98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

21、l为(ggggs)m，其中，m＝0,1,2,3,或4。

22、作为上述融合蛋白的优选实施方案，其具有如seq id no:11所示的氨基酸序列：

23、qvqlqesggglvqpggslrltcapsgftldyyaigwfrqapgkeregvscissnn styyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaaepdysgvyyytcgw tdfgswgqgtqvtvssviaelppkvsvfvpprdgffgnprksklicqatgfsprqiqvs wlregkqvgsgvttdqvqaeakesgpttykvtstltikesdwlgqsmftcrvdhrg ltfqqnassmcvpdqdtairvfaippsfasifltkstkltclvtdlttydsvtiswtrqn geavkthtniseshpnatfsavgeasiceddwnsgerftctvthtdlpsplkqtisrpk gvalhrpdvyllppareqlnlresatitclvtgfspadvfvqwmqrgqplspekyvts apmpepqapgryfahsiltvseeewntgetytcvvahealpnrvtertvdkstgkptl ynvslvmsdtagtcy(seq id no:11)。

24、第二方面，本发明提供了一种纳米抗体融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白从n端到c端的结构如式(i)所示：

25、a-l-b    (i)

26、其中，

27、a为单条、特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体的vhh链，所述特异性结合 sars-cov-2rbd的纳米抗体的vhh链如上述第一方面中所定义；或者，a为根据上述 第一方面的优选的具体实施方案i中所述的多价纳米抗体，即，由两条以上、优选地三条 所述特异性结合sars-cov-2rbd的纳米抗体的vhh链通过linker连接构成的多价纳米 抗体，其中，所述linker为(ggggs)n，其中，n＝1,2,3,或4，优选地，n＝2或3；

28、b为人源igm的fc片段；优选地，所述人源igm的fc片段具有如seq id no:10所示的氨基酸序列，或与seq id no:10所示的氨基酸序列具有至少95％，96％，97％，98％ 或99％序列同一性的氨基酸序列；

29、l为(ggggs)m，其中，m＝0,1,2,3,或4。

30、作为上述融合蛋白的优选实施方案，其具有如seq id no:11所示的氨基酸序列。

31、第三方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的多价纳米抗 体，或者编码如上述第二方面所述的纳米抗体融合蛋白。

32、在具体实施方案中，所述多核苷酸为dna或mrna；

33、优选地，所述多核苷酸编码根据上述第一方面的优选的具体实施方案i的多价纳米 抗体，进一步优选地，所述多核苷酸包括如seq id no:12(即， caggtccaactccaagagagcggcggcggcctcgtccaacccggaggatcactc agactcacatgcgccccaagcggcttcacactcgactactacgccatcggctggtt cagacaagcccccggcaaagagagagaaggagtgtcttgcattagcagcaacaa cagcacctactacgccgacagtgtcaaaggaagattcaccatcagcagggacaac gctaagaacaccgtgtatctccagatgaactcactgaagcccgaggacaccgccg tgtactactgcgccgccgagcccgactacagcggcgtttactactacacctgcgga tggaccgacttcggcagctggggccaaggaacccaagtcaccgtgagcagcgga ggcggaggaagcggcggtggaggaagtggcggaggcggatctggggggggagg atcaggcggaggaggaagccaggtgcagctgcaggagagcggaggaggactgg tgcagccaggaggaagcctgagactgacatgcgcaccaagcggattcacactggactattatgctatcggatggttcagacaggcccctggaaaagagagagagggggt gagctgcatcagcagcaataactccacatactacgccgatagcgtcaaggggagg ttcactattagcagggacaatgcaaagaacacagtgtacctgcagatgaacagcc tgaagcccgaagacaccgccgtctactactgcgcagccgagcccgattacagcgg cgtgtactactacacatgcggatggacagacttcggctcctggggccaaggcacc caagtgaccgtgtcaagcggaggcggggggagcggaggaggtggaagtggagg ggggggatctggcgggggaggaagtggaggaggaggatcacaggtgcagctcca ggagagcgggggaggactggtccagccaggagggagcctgagactcacatgtgc acccagcggatttacactggattattacgccatcggatggtttaggcaggcacccg ggaaagagagagagggcgtgagctgcattagcagtaataacagcacctattacgc cgactcagtgaaggggcggttcaccataagcagggataacgccaagaacaccgtc tacctgcagatgaatagcctgaaacccgaagacacagccgtgtactattgcgccgc cgaacccgactactctggagtgtactactatacctgcggctggaccgactttggca gctgggggcaaggcacccaggtgaccgtgagcagt)所示的核苷酸序列；

34、优选地，所述多核苷酸编码如上述第二方面所述的纳米抗体融合蛋白，进一步优选 地，所述多核苷酸包括如seq id no:13(即， caggtgcagctgcaggagagcggaggagggctggtgcagcccggaggaagcctg agactgacctgcgcccccagcggattcaccctggattattatgctattggctggtttaggcaggctcccggcaaagagagagagggggtgtcatgcattagcagcaataact caacctactacgccgacagcgtcaagggacgcttcaccatttccagggacaacgc taagaacaccgtgtatctccagatgaatagcctgaagcccgaggacaccgcagtg tactactgcgccgccgagcccgactacagcggtgtgtattactacacctgcggatg gaccgacttcggcagctggggccagggaacccaggtgacagtgagcagcgtgat cgccgagctgccccccaaggtgagcgtgttcgtgccccctagagacggcttcttc ggcaaccctagaaagagcaagctgatctgccaagccaccggcttctcccctagac agatccaagtgagctggctgagagagggcaagcaagtgggcagcggcgtcacaa cagaccaagtgcaagccgaggccaaggagagcggccccaccacctacaaggtga caagcaccctgaccatcaaggagagcgactggctggggcagagcatgttcacctg cagagtggaccacagaggcctgacctttcagcagaacgctagcagcatgtgcgtg cccgaccaagacaccgccatcagagtgttcgccatcccccctagcttcgctagcat cttcctgaccaagagcaccaagctgacctgcctcgtgaccgatctgaccacctac gacagcgtgaccatcagctggacaagacagaacggcgaggccgtgaagacccac accaacatcagcgagagccaccccaacgccaccttcagcgccgtgggcgaggctagcatctgcgaggacgactggaacagcggcgagagattcacctgcaccgtgaccca caccgacctgcctagccccctgaagcagaccatcagcagacccaagggcgtggcc ctgcacagacccgacgtgtacctgctgccccccgctagagagcagctgaacctga gagagagcgccaccatcacctgcctggtgaccggctttagccccgctgacgtgtt cgtgcagtggatgcagagagggcagcccctgagccccgagaagtacgtgacaag cgcccccatgcccgagccccaagcccccggcagatacttcgcccacagcatcctg accgtgagcgaggaagagtggaacaccggcgagacctacacctgcgtggtggcc cacgaggccctgcccaacagagtgaccgagagaaccgtggacaagagcaccggc aagcccaccctgtacaacgtgagcctggtgatgagcgacaccgccggcacctgct ac)所示的核苷酸序列。

35、第四方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸， 以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。例如组氨酸标签、 终止密码子等。

36、第五方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第四方面所述的核酸构建体。

37、第六方面，本发明提供了一种转化的细胞，其包括如上述第三方面所述的多核苷酸、 如上述第四方面所述的核酸构建体或如上述第五方面所述的表达载体。

38、第七方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上述第一方面所述的多价纳米 抗体、如上述第二方面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

39、在具体实施方案中，所述药物组合物可以为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；

40、优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；

41、优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶 囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；

42、优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。

43、本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的 症状等，根据医生的判断来确定。

44、第八方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述的多价纳米抗体、如上述第二方 面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体、如上述第六方面所述的转化的细胞或如 上述第七方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中 的应用。

45、在具体实施方案中，所述新型冠状病毒可以为sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2变异毒株；

46、优选地，所述sars-cov-2变异毒株为alpha(b.1.1.7)、beta(b.1.351)、gamma(p.1)、 kappa(b.1.617.1)、delta(b.1.617.2)毒株、omicron(b.1.1.529)亚型ba.1毒株或omicron (b.1.1.529)亚型ba.2毒株；进一步优选地，所述sars-cov-2变异毒株为delta(b.1.617.2) 毒株、omicron(b.1.1.529)亚型ba.1毒株或omicron(b.1.1.529)亚型ba.2毒株。

47、第九方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述的多价纳米抗体、如上述第二方 面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的转化的细胞在制备用于检测新型冠状病毒或用于诊断新型冠状病毒感染的试剂或试剂盒中的应用。

48、在具体实施方案中，所述新型冠状病毒可以为sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2变异毒株；

49、优选地，所述sars-cov-2变异毒株为alpha(b.1.1.7)、beta(b.1.351)、gamma(p.1)、 kappa(b.1.617.1)、delta(b.1.617.2)毒株、omicron(b.1.1.529)亚型ba.1毒株或omicron (b.1.1.529)亚型ba.2毒株；进一步优选地，所述sars-cov-2变异毒株为delta(b.1.617.2) 毒株、omicron(b.1.1.529)亚型ba.1毒株或omicron(b.1.1.529)亚型ba.2毒株。

50、第十方面，本发明提供了一种新型冠状病毒检测试剂盒，其包括如上述第一方面所 述的多价纳米抗体、如上述第二方面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上 述第六方面所述的转化的细胞。

51、有益效果

52、本发明针对新冠病毒进行纳米抗体构建体的药物开发，本发明的基于纳米抗体s43 的构建体均能以高亲和力与sars-cov-2rbd结合，能以高中和活性中和sars-cov-2 原型毒株和一系列变异毒株的假病毒和活病毒，这些均表明：基于纳米抗体s43的构建 体是能够以高亲和力与sars-cov-2rbd结合的、并具有高中和活性的新型冠状病毒 (sars-cov-2)纳米抗体。

53、特别是，发明人通过一系列实验证明，本发明的基于纳米抗体s43的三价纳米抗体(ts43)和igm五聚体形式(ms43)相对于其单体(即，纳米抗体s43)具有明显提高的中和 活性和显著延长的半衰期，其实现了黏膜免疫，可以限制病毒的繁殖和进一步跨越黏膜 屏障，控制了病毒的黏膜传播，为新型冠状病毒的临床预防、治疗提供了潜在的可雾化 给药的抗体新药，并可实现新型冠状病毒的灵敏、可靠检测。