纳米抗体及其制备方法与应用与流程

17)对其进行蛋白水解后形成可溶性cxcl16趋化因子(soluble cxcl16,scxcl16)，又称分泌型cxcl16。cxcr6是cxcl16的唯一受体，也称孤儿受体bonzo，也是hiv的辅助受体，其基因位于第3号染色体上，由7段跨膜区序列及胞外的氨基端和胞内的羧基端组成。对cxcl16/cxcr6在人类疾病中的报道早先集中在免疫及炎症相关疾病如肝炎、免疫缺陷综合征、动脉粥样硬化等；cxcl16通过诱导和活化t细胞、巨噬细胞、炎症组织中的粒细胞、nkt细胞上的cxcr6受体促进疾病进展。因此，本发明中的纳米抗体也可应用在炎症性疾病的治疗中。
18.相应的，本发明还公开了上述的纳米抗体在制备治疗炎症性肿瘤的药物中的应用。
19.经研究，cxcl16/cxcr6高表达于乳腺癌、肺癌、食管癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、结直肠癌、甲状腺癌乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等，cxcl16/cxcr6能促进宫颈癌、膀胱癌、卵巢癌、神经母细胞瘤和恶性黑色素瘤的侵袭转移，并参与神经胶质瘤的恶性转化。此外，研究表明：胃粘膜相关淋巴瘤向dlbcl转化过程中cxcr7、cxcr6受体表达上调。cxcl16无论是跨膜型还是分泌型的均在霍奇金淋巴瘤(hl)组织和细胞中高表达。另外cxcl16/cxcr6在nhl(非霍奇金淋巴瘤)多种类型中高表达。通过检测临床病人的预后和分期等指标，发现cxcl16/cxcr6表达与dlbcl(弥漫大b细胞淋巴瘤)临床病理特征不良预后呈正相关，提示tm-cxcl16不仅可以作为一种辅助诊断标记，还可能在dlbcl的治疗方面有着极为重要的作用。在体外实验中，cxcl16外源性重组蛋白单独作用时，对dlbcl的增殖等不产生显著影响，但可以促进趋化和迁移作用。综上，cxcl16与多数炎症性肿瘤的不良预后相关(胃癌除外)，与肿瘤的恶性级别和迁徙转移相关。研究也提示它可能促进了一些炎症性肿瘤的恶性转化和转移。因此，可以针对其作为靶点，对于高表达该因子的恶性肿瘤进行干预治疗。
20.相应的，本发明还公开了上述的纳米抗体在制备治疗冠状病毒的药物中的应用。
21.此外，经研究，cxcl16还能与sars-冠状病毒的n蛋白结合，这也提示本发明中的纳米抗体存在治疗冠状病毒的可能。
22.相应的，本发明还公开了上述的纳米抗体的制备方法，其包括：
23.制备cxcl16-hsa重组融合蛋白；
24.采用cxcl16-hsa重组融合蛋白作为抗原免疫羊驼，利用免疫后羊驼的外周血淋巴细胞构建噬菌体文库；
25.采用cxcl16-hsa重组融合蛋白作为抗原对所述噬菌体文库进行淘选，获得纳米抗体。
26.优选的，所述噬菌体文库的构建方法包括：
27.(1)采用cxcl16-hsa重组融合蛋白作为抗原免疫羊驼，取四免或五免后的外周血淋巴细胞，分离并提取总rna，逆转录为cdna；
28.(2)以所述cdna为模板，扩增得到vhh目的片段；
29.(3)将所述vhh目的片段连接到pcomb3xss中；
30.(4)将步骤(3)得到连接产物与电穿孔感受态细胞共同电转化，即得到噬菌体文库。
31.优选的，所述cxcl16-hsa重组融合蛋白的制备方法包括：
32.(1)构建cxcl16-hsa载体，其氨基酸核苷酸序列如seq id no.3所示；
33.(2)将所述载体通过转化抽提得到质粒；
34.(3)将所述质粒转入293f细胞转染表达，进行抗原表达，得到cxcl16-hsa重组融合蛋白。
35.实施本发明，具有如下有益效果：
36.本发明提供一种纳米抗体氨基酸核苷酸序列，提供该纳米抗体的制备方法，所制备的抗体具有分子量小，亲和力高，结构稳定的特点。
37.该纳米抗体可能应用在制备治疗炎症性疾病、冠状病毒的药物中，尤其是在制备高表达cxcl16的炎症性肿瘤的抗肿瘤药物中具备极好的应用前景。
附图说明
38.图1是实施例1中cxcl16-hsa蛋白的sds-page鉴定结果图；其中，左侧为cxcl16-hsa蛋白，右侧为dnamarker；
39.图2是实施例1中cxcr6质粒表达载体示意图；
40.图3是实施例1中转染细胞的检测结果示意图；
41.图4是实施例2中提取rna的检测结果；其中，泳道1为marker，泳道2、3为样品rna；每个样品中从上到小条带对应的分别为28s、118s和5s rna；
42.图5是实施例2中vhh基因第一轮扩增后的pcr检测结果图；泳道中上边条带为普通抗体重链区域，下边条带为纳米抗体重链区域；
43.图6是实施例2中vhh基因第二轮扩增后的pcr检测结果图；
44.图7是实施例2中pcr鉴定噬菌体库克隆插入率结果1；每一个电泳条带代表对应克隆菌中pcr扩增得到的vhh片段；
45.图8是实施例2中pcr鉴定噬菌体原始文库克隆插入率结果2；每一个电泳条带代表对应克隆菌中pcr扩增得到的vhh片段；图9是实施例2中噬菌体原始文库的库容检测结果图；
46.图10是实施例3中阳性噬菌体的elisa检测结果图1；
47.图11是实施例3中阳性噬菌体的elisa检测结果图2。
具体实施方式
48.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
49.实施例1抗原的制备与评价
50.一、抗原的制备
51.具体的抗原制备方法如下：
52.1、选取cxcl16分子胞外段序列进行表达，构建cxcl16-hsa融合表达载体，该载体构建方法如下：合成cxcl16-has基因模板，将该基因通过酶切连接方式克隆到pcdna3.1载体上。其氨基酸核苷酸序列如seq id no.3所示。
53.2、将cxcl16-hsa融合表达载体通过质粒大抽试剂盒抽提得到细胞瞬转用质粒；
54.3、通过293f细胞瞬转表达计数处于对数生长期的293f，用新鲜的293培养基重新悬浮细胞，使其密度达到4
×
106/ml，总体积100ml。
55.1)用1000μl培养基稀释100μg质粒。
56.2)用600μl培养基稀释pei(1μg/μl)，将稀释后的pei加到稀释后的质粒dna中。旋转和/或颠倒试管或用移液器轻轻吹打2至3次进行混合。将复合物在室温下孵育约20min。
57.3)将质粒/pei混合物加入细胞悬液中，在添加过程中轻轻摇动摇瓶，放置在37℃，8％co2，125rpm中培养。
58.4)在转染后16-22h向摇瓶中添加5％(v/v)补料，在添加过程中轻轻晃动摇瓶，将摇瓶放回37℃培养箱。
59.5)6天收获上清。利用has亲和纯化柱纯化蛋白，得到cxcl16-hsa重组蛋白。
60.二、抗原的评价
61.(一)蛋白纯度评价
62.采用sds-page实验检测表达后蛋白纯度，结果如图1所示。从图中可以看出，成功表达和制备cxcl16-hsa蛋白，分子量大小符合预期。
63.(二)生物活性评价
64.cxcr6是cxcl16分子的受体，为了检测表达出来的cxcl16是否具备识别cxcr6分子的完整生物学活性，构建了cxcr6过表达稳转细胞株。具体的如下：
65.1.质粒构建
66.将要表达的蛋白分子cxcr6基因(氨基酸核苷酸序列如seq id no.4所示)通过ecori/xbai酶切位点克隆构建到表达载体psg1013上，该载体表达框如图2所示；过表达的细胞同时表达cxcr6和gfp基因，同时表达嘌呤霉素基因用于筛选。
67.2.细胞转染与筛选
68.转染前18-24h进行293f细胞的铺板，以便在转染时，细胞的密度大约在80％左右。
69.2.1准备pei-40-dna复合物
70.1)转染前将所有试剂置于室温10min。
71.2)将1μg质粒dna稀释到40μl 1640培养基，用移液枪吹吸3-4次。
72.3)将3μl pei-40转染试剂稀释到40μl无血清的1640培养基，用移液枪吹吸3-4次。
73.4)将稀释好的pei-40转染试剂一次性全部加入到已稀释好的质粒dna中，立即用移液枪吹吸3-4次。
74.5)室温放置10-15min，以形成pei-40-dna复合物。
75.2.2转染细胞
76.1)将上述80μl pei-40-dna转染复合物均匀滴入到含细胞的培养皿中。轻轻晃动培养皿或轻微涡旋，让pei-40-dna复合物分散均匀。
77.2)在co2培养箱中37℃下孵育细胞，转染后12-18h，去除含pei-40-dna复合物的培养液。
78.3)转染24h后加入10μg/ml嘌呤霉素筛选，每隔3天更换一次培养基，连续培养筛选3周，之后大量扩增筛选后获得克隆细胞。
79.3.流式分选及细胞鉴定
80.流式染色前先将cxcl16-hsa蛋白用biotin标记试剂盒进行biotin标记，用于后续流式染色。
81.将扩增后的细胞收集和pbs清洗，过表达细胞利用cxcl16-hsabiotin作为一抗，sreptavdinpe二抗染色，检测过表达的cxcr6细胞是否识别cxcl16分子。
82.4.检测结果
83.检测结果如图3所示，从图中可以看出，与对照组293f细胞相比，cxcr6细胞gfp荧光信号为阳性，同时cxcl16-hsabiotin染色的pe信号也为阳性。说明成功构建了cxcr6过表达细胞株。同时也说明本实施例制备得到的cxcl16-has蛋白具备完整生物学功能，可以识别cxcr6配体。
84.实施例2噬菌体文库的构建
85.一、抗原的制备
86.具体的抗原制备方法如实施例1。
87.二、免疫
88.(一)免疫程序
89.选取1只健康成年羊驼，采取背部皮内、皮下多点注射的方式进行免疫，第一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，后续免疫用佐剂为弗氏不完全佐剂。具体免疫程序如下表所示：
[0090][0091]
(二)免疫效价检测
[0092]
1、检测方法
[0093]
利用elisa方法检测动物免疫后血清效价水平，具体方法如下：
[0094]
a、将抗原稀释至5μg/ml，按100μl/well，4℃包被过夜；
[0095]
b、弃包被液，tbst洗涤3次，每孔加入300μl 3％脱脂牛奶，37℃封闭1h；
[0096]
c、tbst洗涤3次，加入100μl/孔的血清稀释液(从1:2000开始倍比稀释)，37℃孵育45min；
[0097]
d、tbst洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗lama二抗(用5％脱脂牛奶，按1:10000体积比例稀释)100μl/孔，37℃孵育45min；
[0098]
e、tbst洗板3次。加入tmb显色液显色，100μl/孔，37℃，5min，加入终止液终止反应，50μl/孔，于450nm下测光密度。
[0099]
2、实验结果
[0100]
将制备好的cxcl16蛋白对羊驼共进行5次免疫，免疫后取血检测效价，结果如下表所示，效价达到：1:128000，符合建库标准。
[0101][0102]
三、pbmc分离
[0103]
取动物四免和五免后的外周血，分离pbmc；具体方法如下：
[0104]
1、取50ml新鲜动物外周血样本，采用等体积pbs稀释后，缓慢加入至等体积的淋巴细胞分离液中，800g离心20min；
[0105]
2、小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新离心管中，加入等体积pbs混匀后，700g离心20min；
[0106]
3、弃掉上层溶液，将白细胞沉淀用0.3ml pbs重悬，其余加入0.6ml trizol溶液，混匀后于-80℃保存备用。
[0107]
四、rna提取
[0108]
(一)rna提取
[0109]
1、将trizol溶液保存的白细胞离心，收集沉淀，然后用0.01m pbs离心洗涤一次，弃掉pbs。
[0110]
2、按200μl氯仿/mltrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
[0111]
3、4℃12000g离心15min。
[0112]
4、吸取上层水相，至另一离心管中。
[0113]
5、按0.5ml异丙醇/mltrizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。
[0114]
6、4℃12000g离心10min，弃上清，rna沉于管底。
[0115]
7、按1ml 75％乙醇/mltrizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃8,000g离心5min，弃上清。
[0116]
8、室温晾干或真空干燥5-10min。
[0117]
9、用50μl h2o溶解rna样品。
[0118]
(二)rna检测
[0119]
取提取后rna样品进行电泳测试，结果如图4所示。从图中可以看出：rna完整性良好，成功分离和提取细胞rna。
[0120]
五、cdna合成
[0121]
反转录体系如下：
[0122]
step 1
[0123]
random hexamers1μldntp mix(10mm each)1μltotal rna4μgdepc-treated waterup to 10μl
[0124]
混匀后，65℃保温5min，迅速冰浴；
[0125]
step2
[0126]
step1反应液10μl10
×
rt buffer2μl25mm mgcl24μl0.1m dtt2μlrnaseout1μlsuperscript iii rt1μl
[0127]
混匀后，按如下条件反转录：25℃10min；50℃50min；85℃5min；离心后每管加入1μl rnase h 37℃，20min。
[0128]
六vhh基因扩增
[0129]
采用巢式pcr扩增vhh基因，方法如下：
[0130]
step1
[0131]2×
phanta mix buffer25μldntp mixture(each 2.5mm)4μlprimer alpvh-ld(10mm each)2μlprimer ch2-r(10mm each)2μlcdna1μl高保真聚合酶1μlh2oup to 50μl
[0132]
反应条件：退火：50℃15s；循环25次；延伸：72℃1min。
[0133]
其中，primeralpvh-ld的序列如seq id no.5所示，primer ch2-r的序列如seq id no.6所示。
[0134]
反应结束后，pcr产物采用普通dna产物纯化试剂盒纯化，然后电泳测试，结果如图5所示，从图中可以看出，第一轮扩增出传统抗体的重链片段(大片段)和纳米抗体片段(小片段)。
[0135]
step2
[0136][0137][0138]
反应条件：退火：55℃15s；循环30次；延伸：72℃30s。
[0139]
其中，primer alp-phage-f1的序列如seq id no.12所示，primer alp-phage-r1的序列如seq id no.7所示，primeralp-phage-r2的序列如seq id no.8所示。
[0140]
第二轮反应结束后，pcr产物采用普通dna产物纯化试剂盒纯化，用于后续步骤。
[0141]
此外对pcr产物进行电泳测试，结果如图6所示，从图中可以看出，第二轮pcr扩增后，成功富集纳米抗体pcr片段。
[0142]
七噬菌体文库构建
[0143]
(一)目的片段vhh与载体pcomb3xss的酶切与连接
[0144]
1、酶切
[0145]
目的片段双酶切体系(100μl体系)如下：
[0146]
目的片段70μl(15μg)sfii酶10μl
ddh2o10μl10
×
buffer10μl总计100μl
[0147]
50℃酶切酶切过夜。
[0148]
载体双酶切体系(100μl)如下：
[0149][0150]
50℃酶切酶切过夜。
[0151]
2、连接
[0152]
酶切纯化后的vhh和pcomb3xss采用如下连接体系连接：
[0153]
10
×
buffer10μlvhh酶切产物100ngpcomb3xss酶切产物200ngt4 dna ligase(400u/μl)1μlh2oup to 50μl
[0154]
连接程序为：
[0155]
a、16℃连接12h后，65℃10min灭活连接酶；
[0156]
b、加入1/10体积3mnaac，混匀后，加入2倍体积无水乙醇，-20℃静置1h；
[0157]
c、12000rpm离心10min；
[0158]
d、70％乙醇-去离子水洗涤沉淀，12000rpm离心5min；
[0159]
e、10μl无菌水重悬沉淀。
[0160]
(二)辅助噬菌体扩增与滴度测定
[0161]
a.、接种e.coli tg1单菌落于5ml 2
×
yt培养基中，37℃220rpm培养至对数期，备用；
[0162]
b、用2
×
yt培养基10倍梯度稀释辅助噬菌体m13k07，分别取10μl不同稀释度的噬菌体加入到100μltg1培养物中，快速振荡混匀，37℃温育10min；
[0163]
c、将温育后的e.coli tg1与噬菌体混合物加入至上层琼脂中，迅速混匀后倾倒在37℃预温的2
×
yt培养皿上，待培养基凝结后倒置平板，37℃培养16h后，计算平板上的噬菌斑数量，以噬菌斑为30-300个左右的平板计数为准，计算噬菌体溶液的滴度；
[0164]
d、从噬菌体滴度测定平板上，挑取一个独立的、较大的噬菌斑接种到5ml2
×
yt-k(含对数生长期tg1)试管中，37℃250rpm培养12h；
[0165]
e.取1ml培养物接种到100ml 2
×
yt-k培养基(含对数生长期tg1)中，30℃250rpm培养12h，收集培养物，10000rpm离心20min，收集上清液；
[0166]
f、加入1/5体积的peg/nacl溶液，充分混匀后置于冰上1h，4℃10000rpm离心20min，去上清，收集沉淀，溶解于1ml无菌pbs中(或10～50％甘油冻存-80℃)
[0167]
g、测定扩增后辅助噬菌体m13k07的滴度。
[0168]
具体的，根据测定，滴度为1
×
10
12
。
[0169]
(三)电穿孔感受态细胞的制备
[0170]
a、从lb平板上挑取一个e.coli tg1单菌落，接种于5ml lb培养液中，37℃振荡培养12h，按1:100的比例将e.coli tg1过夜培养物接种到500ml lb培养液中，37℃振荡培养至od600为0.5(或低温18、25度，od600为0.45)；
[0171]
b、将培养物冰浴30min后，4℃800g离心10min，弃上清；用500ml预冷的无菌水重悬细胞，随后4℃800g离心10min，弃上清
[0172]
c、用250ml预冷的甘油-去离子水溶液(甘油/去离子水：10/90，v/v)重悬细胞，4℃1000g离心10min，沉淀细胞，用15ml预冷的甘油-去离子水溶液重悬细胞，4℃1000g离心10min，收集细胞
[0173]
d、将细胞用1ml 2yt溶液重悬，50μl/支分装。
[0174]
(四)电穿孔转化
[0175]
a、取感受态细胞置于冰上融化，分别加入2μl连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min
[0176]
b、将上述混合液分别转入0.2cm的电击杯中，调节电击参数：电压为2.5kv
[0177]
c、每次电击后，立即加入0.8ml 37℃预热的lb培养基于电击杯中悬浮细胞，37℃培养1h后，将所有电穿孔后的细胞混合均匀
[0178]
d、取50μl混匀后的细胞溶液梯度稀释，每个梯度分别取100μl涂布lb培养皿，37℃培养16h，计算培养皿上的菌落数，用于计算库容
[0179]
e、将剩余的培养物均匀涂布于10块培养皿(φ150mm)，37℃倒置培养16h
[0180]
f、用lb培养液将10块培养皿上的菌落洗脱后混匀，取2ml用于噬菌体救援，其余加入终浓度15％的甘油后于-80℃保存。
[0181]
(五)噬菌体文库鉴定
[0182]
从计算库容的培养皿上随机挑取100个转化子，进行菌落pcr验证，分析插入率，目的基因插入率＝插入vhh的阳性克隆数/随机挑取的转化子总数
×
100％，实际库容＝菌落总数
×
目的基因插入率。1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。测定结果如图7、图8所示，从图中可以看出，每个克隆均可有效插入抗体序列。
[0183]
此外，电转复苏后细菌培养体积为20ml，取100μl，稀释10e5倍后涂布(图9)，经计算后噬菌体建库库容为：1
×
109。
[0184]
八噬菌体原始文库的救援、扩增与滴度测定
[0185]
a.接种至少10倍库容量的活细胞于50ml 2
×
yt-ga培养基的三角瓶中，37℃220rpm振荡培养至od600＝0.5；
[0186]
b.按细胞：辅助噬菌体＝1:100的比例加入m13k07噬菌体，37℃静置15min后，37℃220rpm振荡培养45min；
[0187]
c.将上述培养物1000g离心10min，收集菌体，采用100ml 2
×
yt-ak培养液重悬菌体，30℃250rpm振荡培养8h；
[0188]
d.将上述培养物于4℃10000rpm离心20min，收集上清；
[0189]
e.加入1/5体积的peg/nacl溶液，混匀后置于冰上放置1h；
[0190]
f.4℃10000rpm离心20min，弃上清，将沉淀重悬于5ml pbs中，加入1/5体积的peg/nacl溶液，混匀后置于冰上1h；
[0191]
g.4℃10000rpm离心20min，弃上清，将沉淀悬浮于500μl pbs中，测定滴度，用于淘选。
[0192]
实施例3纳米抗体筛选
[0193]
一、亲和淘选
[0194]
实施例2得到的文库进行亲和淘选。
[0195]
(一)亲和淘选
[0196]
1)将靶分子用pbs稀释至终浓度为100μg/ml，按100μl/孔加入酶标孔中，4℃包被12h；
[0197]
2)弃包被液，pbs洗涤3次，每孔加入300μl 3％bsa-pbs封闭液，37℃封闭2h；
[0198]
3)pbs洗涤6次，取10μl噬菌体文库与90μl pbs(第二、三轮用含1％bsa或ova)混合，然后加入到酶标板孔中，37℃孵育2h；
[0199]
4)吸出未结合的噬菌体，用pbst洗涤5次，pbs洗涤10次；
[0200]
5)加入100μl gly-hcl洗脱液(含bsa，降低吸附损失)，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至一无菌离心管中，迅速用50μltris-hcl中和缓冲液中和；
[0201]
7)取10μl进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选。
[0202]
8)将文库扩增结果进行下一轮淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如下表所示：
[0203][0204]
(二)淘选后文库的扩增
[0205]
1)将淘选洗脱物与处于对数生长前期的e.coli tg1培养物5ml混匀，37℃，220r/min振荡培养45min后，转移至20ml 2
×
yt-a液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养2h，按cell：phage＝1：20的比例加入m13k07噬菌体，37℃，静置15～30min后，220r/min振荡培养30～45min；
[0206]
2)将培养物分装于离心管中，4℃，3500r/min、10min(2200g,15min)，细胞沉淀以25ml 2
×
yt-ak液体培养基重悬，30℃，250r/min振荡培养过夜；
[0207]
3)将过夜培养物4℃，12000r/min离心10min(7000g,15min)，将上清转移至新离心管，加入1/5体积的peg-nacl，混匀后置于4℃1h以上；
[0208]
4)4℃，12000r/min，10min，去除上清，将沉淀重悬于2ml pbs中，加入1/5体积的peg/nacl，混匀后置于4℃1h以上；
[0209]
5)12000r/min，10min，去除上清，将沉淀悬浮于200μl pbs中，即为扩增产物，测定滴度，用于下一轮淘选或者分析。
[0210]
二、特异性噬菌体克隆的鉴定及分析
[0211]
(一)噬菌粒的救援
[0212]
1)从测定末轮淘选洗脱物滴度的平板上，用灭菌牙签随机挑取50个单菌落接种于1ml 2
×
yt-ga中，37℃，220r/min振荡培养12h。
[0213]
2)按1％接种量接种于2
×
yt-ga，37℃，220r/min，培养至对数生长前期。
[0214]
3)按cell：phage＝1：1的比例加入m13k07噬菌体，37℃，静置15min，220r/min振荡培养30～45min；
[0215]
4)4℃，3500r/min，离心10min，沉淀以等体积2
×
yt-ak重悬，30℃，剧烈振荡培养12h；
[0216]
5)将上述培养物于4℃10000rpm离心10min，收集上清，用于elisa鉴定
[0217]
(二)阳性噬菌体克隆的鉴定
[0218]
1)用pbs将靶分子稀释至5μg/ml，按100μl/孔加入酶标孔中，4℃包被12h；
[0219]
2)弃包被液，pbst洗涤3次，每孔加入300μl 3％脱脂牛奶，37℃封闭2h；
[0220]
3)pbst洗涤3次，加入50μl噬菌体上清与50μlpbs，37℃，孵育1h；
[0221]
4)pbst洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗m13抗体(用3％脱脂牛奶，按1:5000稀释)，100μl/孔，37℃作用1h；
[0222]
5)pbst洗板6次。加入反应底物tmb显色液显色，100μl/孔，37℃，20min，加入终止液终止反应，50μl/孔，于450nm下测光密度。用m13k07包被作为阳性对照，抗原包被加m13k07作阴性对照，抗原包被加pbs作空白对照。阳性克隆判断标准：测试样品od值(s)与阴性对照od值(n)的比值(s/n)≥2.1。
[0223]
(三)阳性噬菌体克隆的序列分析
[0224]
将阳性克隆进行序列测定，采用clustalw软件对测序结果进行多序列比对分析。根据核酸序列推导出氨基酸核苷酸序列，将氨基酸核苷酸序列提交至imgt数据库(the international immunogenetics databases)进行序列比对、分析。
[0225]
(四)实验结果
[0226]
经过淘选后的克隆进行phage elisa检测，结果如下表及图10、11所示，挑取阳性克隆测序。从表中可以看出，有噬菌体克隆与靶点抗原结合。
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[0228][0229]
将上述阳性克隆序列进行测序，对测序后的序列进行比对，目前筛选后的序列高度集中在二条序列，具体序列如seq no.1～2所示。
[0230]
以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
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