一种烟草打顶后延迟其侧枝生长的方法和材料

1.本公开涉及生物工程技术领域，具体地，涉及一种烟草打顶后延迟其侧枝生长的方法和一种重组载体。


背景技术：

2.烟草生产中，为提高烟叶的产量和质量通常要进行打顶以集中营养物质供应叶片的生长。打顶后烟株的每1个叶腋可再生2-3个或更多的腋芽。如任其生长，会消耗大量养分，影响主茎叶片的营养生长。
3.烟草作为叶用作物，任其开花结果会消耗其大量水分，降低烟叶产量和品质。在优质烟草的种植中，“打顶”是调控烟株营养和烟叶产、质量的重要措施，必须在适当时期摘去顶部的花蕾或花序，杜绝烟株体内营养物质的无谓消耗，促使营养物质集中供应叶片生长，增大叶面积和单叶重量。但是，打顶后，腋芽丛生，耗费养分，达不到提高烟叶质量的目的。
4.为了提高烟叶产量和质量，往往需要除去腋芽和抑制其生长。而传统的人工抹芽既费工又麻烦，而且不及时、不彻底，易造成烟杈丛生、烟花满田，也容易传染病害。目前大田生产中使用抑芽剂来抑制打顶后烟株腋芽的发生，抑芽剂的使用既增加生产成本，也导致对环境的污染，因此，培育一种在打顶后腋芽能够被有效抑制，同时避免造成对环境和烟叶的污染，并且应用安全，能够降低生产成本和劳动力投入的方法至关重要。


技术实现要素：

5.为了提高烟叶的产量和质量，本公开提供了一种烟草打顶后延迟其侧枝生长的方法和一种重组载体。
6.一方面，本公开提供了一种烟草打顶后延迟其侧枝生长的方法，所述方法包括以下步骤：
7.将转基因烟草进行播种、育苗和移栽，并进行打顶；所述转基因烟草的基因组中插入有外源核酸；所述外源核酸包括腋芽特异型启动子和由所述腋芽特异型启动子驱动的致死基因；
8.所述腋芽特异型启动子包括nttf1(cen-like protein 4)启动子、cen-like protein 2启动子和cen-like protein 1启动子中的至少一种；
9.所述致死基因为选自白喉毒素a链基因、米曲霉基因rnase-t1和barnase基因中的至少一种。
10.根据本公开，所述白喉毒素a链基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述米曲霉基因rnase-t1的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述barnase基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11.根据本公开，所述nttf1启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示。
12.根据本公开，所述外源核酸如seq id no.5所示。
13.根据本公开，该方法还包括：将如seq id no.5所示外源核酸插入烟草的基因组
中，以制备转基因烟草。
14.另一方面，本公开提供了一种重组载体，该重组载体插入有上述外源核酸。
15.根据本公开，所述外源核酸包括腋芽特异型启动子和由所述腋芽特异型启动子驱动的致死基因；
16.所述致死基因为选自白喉毒素a链基因、米曲霉基因rnase-t1和barnase基因中的至少一种；所述腋芽特异型启动子为选自nttf1(cen-like protein 4)启动子、cen-like protein 2启动子和cen-like protein 1启动子中的至少一种。
17.根据本公开，所述外源核酸如seq id no.5所示。
18.通过上述技术方案，本发明所述的方法构建了腋芽特异型启动子+致死基因的重组载体，利用腋芽特异型启动子驱动致死基因的表达，将重组载体侵染烟草得到阳性植株，打顶后的阳性植株第一叶位的烟草腋芽同对照相比，生长延迟1-2周，由此提高烟草的产量和质量。
19.本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
20.附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
21.图1是nttf1启动子扩增(左)与p
nttf1
::dta重组载体构建(右)示意图。
22.图2是p
nttf1
::dta转基因苗pcr检测结果。
23.图3是转基因t1代植株与对照打顶后第一叶位腋芽四周内生长情况。
具体实施方式
24.以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
25.一方面，本公开提供一种烟草打顶后延迟其侧枝生长的方法，所述方法包括以下步骤：
26.将转基因烟草进行播种、育苗和移栽，并进行打顶；所述转基因烟草的基因组中插入有外源核酸；所述外源核酸包括腋芽特异型启动子和由所述腋芽特异型启动子驱动的致死基因；
27.所述腋芽特异型启动子为选自nttf1启动子、cen-like protein 2启动子和cen-like protein 1启动子中的至少一种；
28.所述致死基因为选自白喉毒素a链基因、米曲霉基因rnase-t1和barnase基因中的至少一种。
29.可选地，其中，所述白喉毒素a链基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述米曲霉基因rnase-t1的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述barnase基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
30.其中，所述白喉毒素既能够在施用腋芽特异型启动子时，使所述转基因烟草的腋芽在打顶后延迟生长，又不影响烟草其它器官组织的生长。
31.可选地，所述nttf1启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示。
32.可选地，所述外源核酸如seq id no.5所示。
33.可选地，该方法还包括：将如seq id no.5所示外源核酸插入烟草的基因组中，以制备转基因烟草。
34.可选地，所述外源核酸可以通过将所述腋芽特异型启动子的核苷酸序列与所述致死基因的序列连接后得到，由此在所述外源核酸插入烟草基因组形成转基因烟草植株后，腋芽特异型启动子启动了所述致死基因的表达，从而使得烟草腋芽延迟生长。
35.另一方面，本公开还提供了一种重组载体，所述重组载体插入有上述外源核酸。
36.可选地，其中，所述外源核酸包括腋芽特异型启动子和由所述腋芽特异型启动子驱动的致死基因；所述致死基因为选自白喉毒素a链基因、米曲霉基因rnase-t1和barnase基因中的至少一种；所述腋芽特异型启动子包括nttf1(cen-like protein 4)启动子、cen-like protein 2启动子和cen-like protein 1启动子中的至少一种。
37.优选地，所述外源核酸如seq id no.5所示。
38.以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
39.实施例1
40.材料：nttf1(cen-like protein 4)上游246bp启动子序列、pbi121载体、致死基因dta及其序列、烟草品种；
41.nttf1上游246bp启动子序列如seq id no.4所示；白喉毒素a链(dta)编码序列如seq id no.1所示；
42.方法：
43.载体构建过程和遗传转化过程
44.pbi121载体的酶切鉴定
45.(1)在0.2ml离心管中，依次混入下列各组分：10
×
buffer m(5.0μl)、质粒dna(5.0μl)、ddh2o(38μl)、bamhl(1μl)/saci(1μl)以及hindiii(1μl)/bamhi(1μl)，反应体积共50μl；
46.(2)混匀后稍离心，37℃温育3h，然后取5.0μl酶切反应液进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，2v/cm恒压条件下电泳20min后，于紫外灯下观察并切胶回收；
47.根据nttf1的上游246bp启动子序列设计引物，采用同源重组的方法构建pbi121-p
nttf1
::dta重组载体，为构建载体的方便，设计了两个酶切位点：hindiii和bamhi；
48.p
nttf1-f:5
’‑
tgattacgccaagcttctcattggtaccacgacgagt-3’seq id no.6 hindiii
49.p
nttf1-r:5
’‑
gaccacccggggatccggatcagacatttttgaaccca-3’seq id no.7 bamhi
50.根据dta的cds序列设计引物，采用同源重组的方法构建pbi121-p
nttf1
::dta重组载体，为构建载体的方便，设计了两个酶切位点：bamhi和saci
51.dta-f：5
’‑
ggactctagaggatccatggatcctgatgatgttgttga-3’seq id no.8 bamhi
52.dta-r：5
’‑
gatcggggaaattcgagctcttagagctttaaatctctgtaggt-3’seq id no.9 saci
53.pcr扩增：在0.2ml的离心管中分别加入以下成分：2
×
phanta max master mix(10μl)、ddh2o(8μl)、f(10mm))(0.8μl)、r(10mm)(0.8μl)、cds质粒模板(0.4μl)；反应总体积20μl；将上述材料混合后在94℃预变性2min后，进行pcr反应：反应参数为94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环后在72℃继续延伸5min，16℃保存；
54.pcr产物的回收：pcr扩增产物的回收采用takara minibest agarose gel dna extraction kit ver.4.0，操作按说明书进行：
55.(1)10μl pcr扩增反应液进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，2v/cm恒电压条件下电泳20min，紫外灯下切下含目的片段的琼脂糖块，并转移至1.5ml离心管中；
56.(2)加入3倍体积的胶块溶解液buffer gm，均匀混合后室温15-25℃溶解胶块；
57.(3)溶解液转移至spin column离心柱；
58.(4)12000rpm/min，25℃离心1min；
59.(5)去除离心管中的液体，加入700μl的buffer wb至spin column离心柱；
60.(6)12000rpm/min，25℃离心30s；
61.(7)重复操作步骤(5)和(6)；
62.(8)去除离心管中的液体，室温下12000rpm/min离心1min；
63.(9)将spin column安置于新的1.5ml的离心管上，在spin column膜的中央处加入30μl灭菌蒸馏水，室温静置1min；
64.(10)12,000rpm/min，25℃离心1min；
65.(11)取1.0μl离心收集的回收液，在nanodrop 2000c分光光度计上进行dna片段浓度测定；
66.目的片段的克隆：按照宝生物公司提供的方法，将pcr扩增片段与酶切回收的线性载体连接：向0.2ml的无菌离心管中加入：2.0μl 5x in-fusion hd enzyme premix、4.0μl线性载体、1.0μl pcr回收产物、3.0μl ddh2o，加入总体积为10.0μl，充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，50℃反应15min；
67.e.coli dh5a感受态细胞的制备：
68.(1)从lb琼脂平板上挑取e.coli dh5a单菌落，接种到10ml不含抗生素的lb液体培养基中，37℃，300rpm/min振荡培养过夜。次日按照1％(v/v)的量转入新鲜lb液体培养基中，37℃振荡培养至0.3-0.4之间；
69.(2)将50-100ml的培养液转入两个预冷的无菌离心管中，于冰上放置30min；
70.(3)4℃，6000rpm/min离心5min，去上清液；
71.(4)向每个离心管中各加入10ml预冷的0.1mol/l的cacl2溶液重悬菌体，冰浴30min；
72.(5)4℃，6000rpm/min离心5min去上清液，再将菌体悬浮于2ml预冷的0.1mol/cacl2溶液中，即为感受态细胞。液氮速冻后于-70℃冰箱保存；
73.连接产物的转化：
74.(1)用无菌吸头取50μl感受态细胞置1.5ml预冷的无菌离心管中，加入2.5μl连接反应液，轻轻混匀，立即置冰上30min；
75.(2)将离心管置于42℃恒温水浴中热激30s；
76.(3)放回冰上3-5min；
77.(4)加入500μl无附加抗生素的lb液体培养基，混匀后37℃下，转速为300rpm/min，振荡培养60min；
78.(5)制备lb附加100mg/ml卡那霉素的固体平板；
79.(6)吸取100μl菌液移至lb平板上，再用无菌三角头玻棒蒋菌液均匀涂满整个平板
表面；
80.(7)平板于37℃正向放置至液体被吸收，然后倒置平皿，于37℃培养12-16h；
81.lb培养基：酵母抽提物yeast extract 5g/l、蛋白胨tryptone 10g/l、nacl10g/l，加入1000ml蒸馏水溶解，用naoh调节ph值至7.0，121℃灭菌20min；
82.质粒dna的小量提取：
83.(1)用无菌枪头从lb平板上挑取白色单菌落并分别接种到含有amp(100mg/ml)的5ml lb培养基中；
84.(2)37℃、300rpm/min条件下连续振荡培养8～10h；
85.(3)12,000rpm/min，室温离心3min，尽量吸弃上清；
86.(4)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl bufferp1，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
87.(5)向离心管中加入250μl bufferp2，温和地上下颠倒混匀4-6次，使菌体充分裂解；
88.(6)向离心管中加入350μl buffern3，立即温和地上下颠倒混匀4-6次；
89.(7)12000rpm/min离心10min，吸取上清，加入到已装入collection tube的spin column cm中；
90.(8)12000rpm/min离心60s，倒掉collection tube中的废液，将spin column cm放回collection tube中；
91.(9)向spin column cm中加700μl buffer pw，12000rpm/min离心60s，倒掉collection tube中的废液，将spin column cm重新放回collection tube中；
92.(10)向spin column cm中加500μl buffer pw，12000rpm/min离心60s，倒掉collection tube的废液，将spin column cm重新放回collection tube中；
93.(11)12000rpm/min离心60s，倒掉废液。将spin column cm开盖置于室温数分钟，以彻底晾干吸附膜上残余的buffer pw；
94.(12)将spin column cm置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl buffer eb，室温放置2min，12000rpm/min离心1min，溶液收集到离心管中，-20℃下保存质粒。
95.dna序列测定与分析：挑取的阳性克隆进行dna序列测定，测序由北京六合华大完成；
96.pbi121-p
nttf1
::dta重组表达载体的构建：目的片段的酶切及回收：将nttf1启动子插入到载体pbi121，酶切位点为hindiii和bamhi，将dta插入到pbi121-p
nttf1
::gus重组载体中，酶切位点为bamhi和saci，构建带有dta基因的表达载体pbi121-p
nttf1
::dta，如图1所示，nttf1启动子扩增(左)与p
nttf1
::dta重组载体构建(右)；
97.pbi121-p
nttf1
::dta重组表达载体的鉴定：将上述连接产物转化大肠杆菌然后用pcr筛选阳性菌斑，将阳性菌斑送测，测序结果正确即构建成功。
98.农杆菌感受态制备：
99.(1)从yep平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落(eha105)，接种于含50μg/ml利福平的yep液体培养基中，200rpm/min，28℃培养约36h；
100.(2)取第一次活化的菌液2ml接种于50ml含相同抗生素的yep液体培养基中在相同
条件下培养至od600达0.5；
101.(3)将菌液移至50ml无菌离心管，冰浴30min；
102.(4)4℃下，以5000rpm/min转速离心10min，收集菌体；
103.(5)去除上清液，将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15m的nacl溶液中，离心收集菌体；
104.(6)再悬浮于1ml 20mm冰预冷的cacl2溶液中，以50μl/管将菌液分装在1.5ml无菌eppendorf管中，置液氮中速冻1min，-80℃保存备用。
105.yep培养基：每升含有：牛肉浸膏10g，酵母提取液10g，nacl 5g，ph 7.0；
106.重组载体转化农杆菌：
107.(1)50μl农杆菌感受态细胞中插入质粒dna 0.1-1μg(5-10μl)，然后冰浴30min；
108.(2)放入液氮中1min，然后立刻放入37℃水浴锅中水浴5min；
109.(3)取出离心管，加入0.5ml lb，28℃、220rpm/min振荡培养3-5小时；
110.(4)取出菌液，涂布于含卡那霉素(100mg/ml)和利福平(20μg/ml)的lb平板上，在培养箱中28℃前提下倒置培养，2天左右菌落可见；
111.农杆菌单克隆菌落pcr验证：挑取单菌落，接入含有卡那霉素(100mg/ml)和利福平(20μg/ml)的2ml离心管中，200rpm/min，28℃培养约18h。
112.农杆菌介导烟草的遗传转化：
113.烟草无菌苗的培养：用15％的次氯酸钠浸泡红花大金元烟草种子10分钟，再用无菌水冲洗3次，将种子点播于ms培养基上，培养基成分如表1(发苗)所示，移至植物光照培养室培养，一个月后取叶片做侵染；
114.农杆菌侵染液的制备：利用保存的原菌液(-80℃)，取100μl加入到yeb液体中(使用三角瓶，200ml/瓶+100mg/ml壮观霉素+20μg/ml利福平)，28℃，200rpm/min，黑暗条件下培养18h左右至od＝0.6-0.8。4000rpm/min离心5min将菌液收集，利用ms0稀释到od600＝0.8，然后加入20μg/ml的乙酰丁香酮；
115.yeb培养基：每升含有：tryptone 5g，酵母提取物1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏5g，蔗糖5g，ph 7.0；
116.遗传转化的过程：剪去0.5cm无菌叶片浸入菌液5min，用无菌滤纸吸干后叶脉朝上，平铺到共培养培养基(g)上，22℃黑暗培养3天，将共培养的叶片叶脉朝下接种到s1培养基上，放到人工气候室，25℃左右培养2-3周，见叶片边缘长出丛芽，芽长在0.1-0.5cm，将s1培养基上的丛芽转接到s2培养基上，光下培养1-2周，丛芽长成幼小的小苗。将s2培养基上的幼小小苗掰取到s3培养基上，光下培养1-2周，小苗逐渐健壮。将s3培养基上健壮的苗子，去除底部膨大的部分和下部发黄的叶片，接种到生根培养基(r)上，光下培养1-2周时间，待生根后移栽到营养钵中。
117.表1烟草遗传转化过程各个步骤使用的培养基
[0118][0119]
对每一颗转基因苗提取dna进行pcr检测，结果如图2所示。图2中，自左至右每个泳道的样品分别为转基因植株1-5，结果显示转基因植株1、3、4、5为阳性植株。
[0120]
转基因植物的dna提取及pcr检测过程如下：
[0121]
(1)取植物新鲜组织100mg左右，加入液氮充分研磨；
[0122]
(2)将研磨后的粉末收集到1.5ml离心管中，加入400μl buffer lp1和6μl rnase a(10mg/ml)，涡旋振荡1分钟，室温放置10分钟，使其充分裂解；
[0123]
(3)12000rpm/min离心5min，将上清液移至新的1.5ml离心管中；
[0124]
(4)加入1.5倍体积的buffer lp3，充分混匀；
[0125]
(5)将上步所得溶液和沉淀全部加入到spin columns dm中，12000rpm/min离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0126]
(6)向吸附柱中加入500μl buffer gw2，12000rpm/min离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0127]
(7)重复步骤(6)；
[0128]
(8)12000rpm/min离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
[0129]
(9)将吸附柱放到一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm/min离心1分钟，收集dna溶液，-20℃保存dna；
[0130]
转基因植株阳性验证pcr引物：
[0131]
p
nttf1-f：5
’‑
ctcattggtaccacgacgag-3’seq id no.10，
[0132]
dta-r：5
’‑
ttagagctttaaatctctgtaggt-3’seq id no.11；
[0133]
转基因阳性植株与对照植株的打顶实验及表型观察：
[0134]
对转基因t1代植株、对照植株进行打顶处理，观察四周内腋芽的生长情况，如图3所示；图3中，f到j为对照植株，a到e为转基因阳性植株，可见对照植株的腋芽生长正常，而本公开获得的转基因植株的腋芽在第一周同对照植株相比起始延迟，从第二周开始腋芽生长与对照植株一致。
[0135]
通过上述技术方案，本发明利用腋芽特异启动子驱动致死基因表达，构建了腋芽特异启动子+致死基因的重组载体，利用该重组载体能够有效延迟烟草腋芽的生长。
[0136]
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这
些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0137]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0138]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。