纳豆激酶重组表达载体、重组基因工程菌及应用的制作方法

1.本发明涉及纳豆激酶的重组表达载体、重组基因工程菌及应用，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.纳豆激酶(nattokinase，nk，ec 3.4.21.62)是在纳豆发酵过程中，其中的纳豆芽孢杆菌利用黄豆中的营养，发酵产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。该酶因其高效安全的溶栓能力，在心脑血管疾病领域掀起研究热潮。在此之前，常用临床溶栓药物主要有链激酶、尿激酶和纤维酶原激活因子等，但此类药物存在成本高昂、安全性低且药效短等弊端，不宜进行规模化生产。纳豆激酶无论在成本还是安全性方面均有显著优势，特别是它可直接作用于纤维蛋白，大大提高溶栓效率，使其与上述溶栓药物相比具有独特优越性和广阔开发前景。此外，纳豆激酶被证实在血压血脂调节方面有显著效果，且在抗疲劳、抗菌、抗氧化、调节内分泌等方面有研究价值，是一种高潜力的膳食补充剂，在食品工业上具有较大开发意义。
3.nakamura等人(1992)通过当时较为精确的鸟枪法首次克隆了纳豆激酶基因，并对其一级结构进行深入解析，测定了该酶的全基因序列，从此科研工作者开始从分子水平，利用基因工程手段对纳豆激酶基因或其宿主进行改造和优化。
4.启动子(promoter)是dna转录起始所必须的一段保守序列，含有rna 聚合酶特异性结合位点，位于基因转录起始位点(transcription start site，tss) 上游，它控制转录强度，是实现异源表达的关键元件。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题在于提供生产纳豆激酶的重组表达载体、重组基因工程菌及应用，本发明以枯草芽孢杆菌为宿主，通过改造信号肽和串联启动子的方式，构建了枯草芽孢杆菌纳豆激酶高表达菌株，提高蛋白酶活力。
6.本发明是通过如下技术方案来实现的：
7.一种纳豆激酶重组表达载体，载体为pp43nmk，在所述的载体的启动子之前串联有1个如seq id n0.1所示的启动子；
8.进一步的，所述重组表达载体的中纳豆激酶基因的信号肽为seq id n0.15。
9.本发明还提供含上述重组表达载体的重组基因工程菌，所述菌株枯草芽孢杆菌，优选为枯草芽孢杆菌wb800。
10.本发明还提供所述重组表达载体在生产纳豆激酶中的应用。
11.本发明还提供所述重组基因工程菌在生产纳豆激酶中的应用。
12.作为优选的实施例，重组表达载体和重组基因工程菌中的重组目的基因纳豆激酶基因来源于纳豆芽孢杆菌bacillus natto n2，其核苷酸序列如seq id n0.2 所示
13.本发明与现有技术相比的有益效果：
14.1、本实验实现了纳豆芽孢杆菌bacillusnatton2来源的纳豆激酶基因在枯草芽孢杆菌wb800中的高效表达。
15.2、本发明提供了一种串联启动子同时对信号肽进行改造的方式构建的基因工程菌以提供纳豆激酶的表达量，所述表达量从22.3fu/ml增加至247.1fu/ml。
附图说明
16.图1是实施例1中nattokinase基因扩增电泳图；其中泳道m：markerdna；泳道1为构建的启动子片段；
17.图2是实施例1中nattokinase基因菌落pcr结果图；其中泳道m：markerdna；泳道1为构建的启动子片段；
18.图3实施例2中构建信号肽与原信号肽相比，纳豆激酶酶活力的比较。
19.图4是实施例3中串联启动子结构示意图；px表示增加的启动子，p43是所用质粒载体pp43nmk的启动子，即载体pp43nmk所原有的启动子。sp7为改造后筛选出来的信号肽，pro-nk是目的基因，即纳豆激酶基因；
20.图5是实施例3中串联启动子扩增电泳图；其中泳道m：markerdna；泳道1为构建的启动子片段；
21.图6是实施例4中串联启动子与原启动子引导的纳豆激酶酶活力的比较。
具体实施方式
22.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
23.以下实施例中所采用的的分子生物学实验技术包括pcr扩增、质粒提取、dna片段连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj，russelldw，janssenk，argentinej.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。实施例中所用的核苷酸序列和氨基酸序列如表1所示。
24.枯草芽孢杆菌wb800可以购买商业菌株，本实施例所用的枯草芽孢杆菌wb800为中国海洋大学食品学院应用微生物实验室保藏；
25.枯草芽孢杆菌n2是由中国海洋大学食品学院应用微生物实验室筛选并于2020年3月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmcc：no.19541，保存地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
26.实施例1纳豆激酶高效分泌表达的信号肽的筛选
27.通过优化纳豆激酶的信号肽，构建各种信号肽与纳豆激酶编码基因相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，从克隆中获得提高纳豆激酶分泌效果的信号肽，具体包括以下步骤：
28.(1)构建pp43nmk-nkf载体：提取枯草芽孢杆菌n2基因组dna(天根，细菌基因组提取试剂盒),以两段人工合成片段seqidn0.3、seqidn0.4从枯草芽孢杆菌n2基因组dna中pcr扩增钓取纳豆激酶基因，核酸电泳验证(图1)并纯化回收目的片段待用；以两段人工合成片段seqidn0.5、seqidn0.6从pp43nmk中pcr扩增得到线性化pp43nmk片段；利用dna无缝克隆(clonexpressiionestepcloningkit试剂盒)重组连接纳豆激酶基因和线性化pp43nmk片段，构建重组克隆载体pp43nmk-nkf，核酸电泳验证(图2)。
29.(2)构建信号肽缺失型线性化载体psp0：设计引物seq id n0.7、seq idn0.8基于pp43nmk-nkf,进行线性化载体扩增，制得psp0线性化载体片段。线性化的载体用fast digest dpni进行消化处理，处理后的片段使用纯化试剂盒 (e.z.n.cycle pure kit d6492)纯化后回收备用。
30.(3)yqxm信号肽的钓取及纯化：设计引物seq id n0.9和seq id n0.10 (在实施例中实际设计了很多引物并调取相应的信号肽，但只有设计引物seqid n0.9和seq id n0.10信号肽对纳豆激酶活性提高最大)，以枯草芽孢杆菌 wb800基因组为模板，选择梯度pcr的方式钓取目的基因，扩增体系50μl： 5
×
primestar buffer(mg
2+
plus)10μl，dntp mixture(2.5mm each)5μl，上下游引物(10μm)各2μl，template 1μl，primestar hs dna polymerase(2.5 u/μl)1μl，ddh2o 29μl。梯度pcr扩增程序如下：95℃30sec，95℃15sec(1cycle)； 62℃15sec，72℃30sec，95℃15sec(5cycles)；60℃15sec，72℃30sec，95℃15sec (5cycles)；58℃15sec，72℃30sec(25cycles)；72℃7min(1cycle)。核酸电泳验证并纯化回收目的片段待用。
31.(4)yqxm信号肽引导的纳豆激酶克隆载体pspx的构建及验证：根据所获纯化启动子片段及psp0载体的dna浓度，进行适当稀释，以保证线性化载体和目的片段摩尔比为1:2进行重组连接，将连接后的体系热激法转化e.colidh5α，然后涂布lb(amp)平板进行阳性重组子的筛选。以pp43nmk载体通用引物对构建的载体pspx进行单克隆测序验证。
32.(5)yqxm信号肽表达载体的构建及验证：将测序正确的转化子活化后提取质粒(e.z.n.plasmid dna mini kit d6942试剂盒)，得到含有不同启动子的纳豆激酶克隆载体。将纳豆激酶克隆载体通过电转化到枯草芽孢杆菌wb8 00中，并通过sds-page和纤维蛋白平板产酶进行验证。
33.(6)线性化载体pspxp0的制备：设计引物seq id n0.11、seq id n0. 12基于pspx质粒,进行线性化载体扩增，制得pspxp0线性化载体片段。线性化的载体用fast digest dpni进行消化处理，处理后的片段使用纯化试剂盒(e. z.n.cycle pure kit d6492)纯化后回收备用。
34.实施例2信号肽介导的纳豆激酶表达水平的检测
35.(1)将实施例1获得的阳性转化子接种5ml液体lb(kana)中，孵育后提取质粒测序，将转入正确质粒的转化子接入到tb培养基(kana)中，37℃、 180r/min震荡培养48h，取发酵液于8000r/min离心10min，获得酶液。
36.(2)参照日本纳豆激酶协会制定的紫外分光光度法，酶活力定义：1单位 (1fu)定义为在本程序规定的条件下，使上清液在od
275
处的吸光度每分钟增加0.01的酶的量。
37.(3)纳豆激酶酶活的测定：同时设置纳豆激酶原始信号肽进行生产纳豆激酶的对照组，除使用的原始信号肽seq id n0.16之外，其它步骤与改造后的信号肽相同，与对照组相比，本实施和2共筛选出5个使纳豆激酶活性表达提高的信号肽，其中，由seq id n0.15氨基酸序列编码的信号肽，可以使纳豆激酶的酶活力由22.3fu/ml增加至235.2fu/ml(图3)。
38.实施例3
39.通过将启动子串联在表达载体原启动子前，构建串联启动子与纳豆激酶编码基因相结合的表达载体(图4)，极大提高纳豆激酶分泌效果，具体包括以下步骤：
40.(1)启动子的钓取及纯化：设计引物seq id n0.13和seq id n0.14，以 pspx为模
板，选择梯度pcr的方式钓取目的基因，扩增体系50μl： 5
×
primestar buffer(mg2+plus)10μl，dntp mixture(2.5mm each)5μl，上下游引物(10μm)各2μl，template 1μl，primestar hs dna polymerase(2.5 u/μl)1μl，ddh2o 29μl。梯度pcr扩增程序如下：95℃30sec，95℃15sec(1cycle)； 62℃15sec，72℃30sec，95℃15sec(5cycles)；60℃15sec，72℃30sec，95℃15sec (5cycles)；58℃15sec，72℃30sec(25cycles)；72℃7min(1cycle)。核酸电泳验证(图5)并纯化回收目的片段待用。
41.(2)含串联启动子引导的纳豆激酶克隆载体构建及验证：根据所获纯化启动子片段及实施例1获得的线性载体pspxp0的dna浓度，进行适当稀释，以保证线性化载体和目的片段摩尔比为1:2进行重组连接，进行重组连接，将连接后的体系热激法转化e.coli dh5α，然后涂布lb(amp)平板进行阳性重组子的筛选。以pp43nmk载体通用引物对构建的载体pspx进行单克隆测序验证。
42.(3)含串联启动子引导的纳豆激酶表达载体的构建及验证：将测序正确的转化子活化后提取质粒(e.z.n.plasmid dna mini kit d6942试剂盒)，得到含串联启动子引导的纳豆激酶克隆载体。将纳豆激酶克隆载体通过电转化到枯草芽孢杆菌wb800中，并通过sds-page和纤维蛋白平板产酶进行验证。
43.实施例4启动子介导的纳豆激酶表达水平的检测
44.(4)将实施例3的阳性转化子接种5ml液体lb(kana)中，孵育后提取质粒测序，将转入正确质粒的转化子接入到tb培养基(kana)中，37℃、1 80r/min震荡培养48h，取发酵液于8000r/min离心10min，获得酶液。
45.(5)参照日本纳豆激酶协会制定的紫外分光光度法，酶活力定义：1单位 (1fu)定义为在本程序规定的条件下，使上清液在od
275
处的吸光度每分钟增加0.01的酶的量。
46.(3)纳豆激酶酶活的测定：与原始信号肽和单个启动子构建的纳豆激酶重组基因工程菌相比(即实施例2中的对照组)，再串联一个pp43nmk载体的启动子p43和改造后的信号肽seq id n0.15构建的纳豆激酶重组基因工程菌可以使纳豆激酶的酶活力由22.3fu/ml增加至247.1fu/ml(见图6)。
47.表1
[0048][0049]