一种体内标记p53蛋白的转基因小鼠的构建方法

本发明属于基因编辑领域，具体涉及一种体内标记p53蛋白的转基因小鼠的构建方法。

背景技术：

1、tp53被认为是最重要的抑癌基因，其表达的野生型p53蛋白(wt-p53)作为转录因子，能够响应包括dna损伤在内的多种细胞应激信号，调控细胞周期、凋亡、代谢和自噬等生命过程，是最重要的肿瘤抑制因子之一。不过，tp53在50％以上的人类肿瘤中会发生突变，肿瘤相关tp53突变97％发生在dna结合结构域，其中73％为错义突变，绝大多数能稳定转录、翻译表达出突变p53蛋白(mut-p53)。与其他抑癌基因通常在肿瘤中缺失或低表达不同，mut-p53在终末期肿瘤细胞中大量积累，远高于非肿瘤细胞wt-p53的表达水平，其高表达已经作为一种特异性标志物被广泛应用于肿瘤病理诊断和预后判断。

2、研究表明，mut-p53可能通过三种作用机制发挥作用：1.mut-p53丧失wt-p53蛋白的功能，如引起细胞凋亡、应答dna损伤等；2.由于p53是以四聚体的方式来行使转录因子的功能，在杂合子细胞中，mut-p53通过影响wt-p53蛋白的正常功能，即通过显性负调控的作用方式参与肿瘤的发生发展；3.mut-p53蛋白获得新的功能，如促进肿瘤细胞迁移和转移等，从而影响肿瘤的进展。然而，关于mut-p53蛋白在肿瘤发生发展中的具体功能和机制仍不清楚，如mut-p53蛋白是否能够作为肿瘤发生早期异常细胞的标记物、mut-p53蛋白在细胞中何时开始积累、积累mut-p53蛋白的早期肿瘤细胞具有怎样的分子特征以及如何逐渐发展为终末期肿瘤等。系统研究这些重要的科学问题需要我们能够对p53蛋白，尤其是mut-p53蛋白水平进行标记和追踪，并获得肿瘤发生发展不同阶段的细胞进行分析。

3、目前p53基因报告系统主要有：1.在体外细胞层面：采用表达p53荧光蛋白或者荧光素酶融合蛋白的病毒感染细胞，实现对p53表达的标记和追踪；2.在体内层面：一种方式是将荧光蛋白或荧光素酶等基因和p53基因通过2a序列串联起来，采用p53基因启动子或常见的启动子(如人巨细胞病毒启动子cmv等)，驱动p53和荧光蛋白或荧光素酶的表达，实现表达p53基因的细胞标记和追踪；另一种方式是采用内源性p53启动子直接驱动荧光蛋白或荧光素酶基因的表达，标记和追踪表达p53的细胞；第三种方式是采用p53应答元件来调控荧光蛋白或荧光素酶的表达，以此来实现对p53表达细胞的标记追踪。

4、然而，现有的p53报告系统存在以下问题：1.体外细胞表达mut-p53荧光蛋白或荧光素酶融合蛋白，能够实现mut-p53蛋白的标记和追踪，但由于体外细胞本身存在局限性，不能很好的反映mut-p53蛋白的体内生物学功能；2.p53蛋白的调控主要反映在翻译后水平。正常情况下，p53 mrna在各种细胞中广泛表达，其翻译的蛋白质通过泛素连接酶mdm2介导的泛素化降解途径维持在低水平。一般认为，tp53基因突变本身并不影响mdm2的识别和泛素化降解。而现有的体内p53报告系统主要是利用p53启动子驱动报告基因的表达，能够反映p53的转录水平，却不能很好的表征p53蛋白水平。2adna序列虽然能够实现两个或多个基因转录成一条mrna分子，但是当mrna翻译成蛋白质后，2a多肽氨基酸序列发生自剪切，产生两个或多个独立的蛋白质。因而，此种策略并不能很好的反应p53蛋白水平的变化。

5、因此，目前仍需要研究一种能够有效对p53蛋白进行体内标记，准确反映其水平变化的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种体内标记p53蛋白的转基因小鼠的构建方法。

2、本发明提供了一种小鼠受精卵，它的trp53基因第五外显子中seq id no.1所示的序列替换为荧光蛋白基因。

3、进一步地，上述荧光蛋白基因是编码mcherry、bfp、gfp、yfp、rfp、tdtomato中的任意一种荧光蛋白的基因。

4、更进一步地，上述荧光蛋白基因是编码mcherry的基因。

5、更进一步地，上述编码mcherry的基因序列如seq id no.2所示。

6、本发明还提供了上述的受精卵的构建方法，包括将含有基因编辑系统的质粒和含有荧光蛋白基因的供体质粒注射到小鼠受精卵中的步骤；

7、所述小鼠受精卵trp53基因第五外显子中seq id no.1所示的序列在含有基因编辑系统的质粒的作用下切除；

8、所述荧光蛋白基因通过同源重组插入小鼠trp53基因第五外显子的序列切除部位。

9、进一步地，上述基因编辑系统是用crispr-cas9基因编辑系统，包括cas9蛋白和sgrna，所述sgrna的序列如seq id no.3、seq id no.4所示。

10、进一步地，上述含有荧光蛋白基因的供体质粒中，荧光蛋白基因两端连接有trp53基因的同源臂。

11、本发明还提供了一种体内标记p53蛋白的转基因小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：

12、(a)按照上述的构建方法构建小鼠受精卵；

13、(b)将步骤(a)得到的小鼠受精卵移植到代孕小鼠中，饲养代孕小鼠，生产得到f0代小鼠。

14、进一步地，上述方法还包括将所述f0代小鼠自交或与野生型小鼠杂交的步骤。

15、本发明的有益效果：本发明通过基因编辑技术，将荧光蛋白基因敲入小鼠trp53基因第5个外显子内(p53-exon5)，不改变编码阅读框，获得基因编辑的受精卵，及其发育得到的表达荧光蛋白标记的p53蛋白的转基因小鼠，实现了p53蛋白准确的体内标记，直接反映p53蛋白的水平，可根据荧光蛋白标记、追踪以及采用流式细胞术分析分选异常细胞，实现对肿瘤细胞特征、肿瘤发展进程的分析监控。

16、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

17、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种小鼠受精卵，其特征在于，它的trp53基因第五外显子中seq id no.1所示的序列替换为荧光蛋白基因。

2.如权利要求1所述的受精卵，其特征在于，所述荧光蛋白基因是编码mcherry、bfp、gfp、yfp、rfp、tdtomato中的任意一种荧光蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的受精卵，其特征在于，所述荧光蛋白基因是编码mcherry的基因。

4.如权利要求3所述的受精卵，其特征在于，所述编码mcherry的基因序列如seq idno.2所示。

5.权利要求1～4任一项所述的受精卵的构建方法，其特征在于，包括将含有基因编辑系统的质粒和含有荧光蛋白基因的供体质粒注射到小鼠受精卵中的步骤；

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述基因编辑系统是用crispr-cas9基因编辑系统，包括cas9蛋白和sgrna，所述sgrna的序列如seq id no.3、seq id no.4所示。

7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述含有荧光蛋白基因的供体质粒中，荧光蛋白基因两端连接有trp53基因的同源臂。

8.一种体内标记p53蛋白的转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，还包括将所述f0代小鼠自交或与野生型小鼠杂交的步骤。

技术总结
本发明提供了一种小鼠受精卵，它的Trp53基因第五外显子中SEQ IDNO.1所示的序列替换为荧光蛋白基因，该受精卵发育而成的个体为体内标记p53蛋白的转基因小鼠，并提供了前述受精卵和转基因小鼠的构建方法。本发明通过p53与荧光标记融合蛋白的表达，实现p53蛋白准确的体内标记，直接反映p53蛋白的水平，可根据荧光蛋白标记、追踪以及采用流式细胞术分析分选异常细胞，实现对肿瘤细胞特征、肿瘤发展进程的分析监控。

技术研发人员：姚朋乐,张燕,汪源,任艳明
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15