一种悬液式生物指示剂保护剂的制作方法

1.本发明涉及一种悬液式生物指示剂保护剂。


背景技术：

2.生物指示剂是一种对特定灭菌程序有确定及稳定耐受性的特殊微生物制品，可用于灭菌设备的性能确认，特定物品的灭菌工艺开发、建立，生产过程灭菌效果的监控以及隔离系统和无菌洁净室除菌效果的验证评估等。因此针对不同灭菌工艺，现已推出多种生物指示剂以进行灭菌效果的验证。
3.悬液式生物指示剂是将芽孢与恢复生长的培养基相混合的生物指示剂，该产品使用方便，但芽孢直接接触液态培养基易促使芽孢萌发，导致在储存过程中芽孢存活率低，储藏稳定性差。因此，寻找并开发出一种生物指示剂保护剂，使其在保存过程中保证芽孢存活、不萌发，抗力波动小，同时也保证其在灭菌测试后不影响芽孢的恢复生长就显得至关重要，以便于悬液式生物指示剂货架寿命的延长。


技术实现要素：

4.本发明为解决现有技术在使用中存在的问题，提供一种在保存过程中保证芽孢存活、不萌发，抗力波动小，同时也保证其在灭菌测试后不影响芽孢恢复生长的悬液式生物指示剂保护剂。
5.本发明解决现有问题的技术方案是：一种悬液式生物指示剂保护剂，作为改进，包括基础培养基及添加于基础培养基中具有保护作用组份，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5-5.0％(w/v)、l-谷氨酸钠0.1-1.0％(w/v)、酪蛋白0.5-5.0％(w/v)、甘油0.5-2.0％(v/v)、硫代硫酸钠0.01-2.0％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。
6.作为进一步改进，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5-4.5％(w/v)、l-谷氨酸钠0.1-0.8％(w/v)、酪蛋白0.5-4.6％(w/v)、甘油0.5-1.8％(v/v)、硫代硫酸钠0.01-1.9％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。
7.作为进一步改进，所述的具有保护作用组份包括蔗糖1.0-4.5％(w/v)、l-谷氨酸钠0.5-0.8％(w/v)、酪蛋白0.5-2.5％(w/v)、甘油0.5-1.0％(v/v)、硫代硫酸钠0.1-0.2％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。
8.作为进一步改进，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5％(w/v)、l-谷氨酸钠1.0％(w/v)、酪蛋白2.0％(w/v)、甘油0.5％(v/v)、硫代硫酸钠0.1％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。
9.作为进一步改进，所述的具有保护作用组份包括蔗糖1.0％(w/v)、l-谷氨酸钠0.5％(w/v)、酪蛋白0.5％(w/v)、甘油1.0％(v/v)、硫代硫酸钠0.2％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。
10.作为进一步改进，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5％(w/v)、l-谷氨酸钠0.5％(w/v)、酪蛋白2.5％(w/v)、甘油1.0％(v/v)、硫代硫酸钠0.1％(w/v)，所述的基础培
养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。
11.作为进一步改进，所述的保护剂ph值为7.2。
12.本发明的保护剂保护原理如下：(1)蔗糖：糖类物质具有大量羟基，能与蛋白质形成氢键，取代膜周边的水分子，形成表层保护膜，稳定蛋白质的结构。对于芽孢，糖类物质的羟基基团，能联结其周围的自由基，可避免芽孢本身暴露在培养基介质中。
13.(2)l-谷氨酸钠：一种由钠离子与谷氨酸根离子形成的盐，属于抗氧化剂类保护剂。能够渗透到细胞内部，在冷存和冻干期间均具有不同的保护效力。
14.(3)酪蛋白：可以在芽孢表面形成蛋白膜，增厚芽孢的保护层，减少其暴露于外界的面积，使得芽孢免受外界环境的破坏而发挥保护作用。经湿热灭菌后蛋白易受到破坏，此时芽孢可以被渗透出来，能够恢复其生长模式。
15.(4)甘油：含有三个羟基，能够与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或与芽孢表面蛋白质极性基团形成氢键，以保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。
16.(5)硫代硫酸钠：作为强还原剂，能够降低芽孢表面的氧化还原电位，减少悬液生物指示剂中的氧气对芽孢的氧化损伤，同时延缓芽孢在冷藏条件下的萌发。
17.本发明与现有技术相比较，有益效果是以溴甲酚紫蛋白胨水溶液为基础培养基，分别以单独或组合方式添加糖类、氨基酸、蛋白质及多肽、多元醇、无机盐等对芽孢具有保护作用的物质，使得该种保护剂能够较好地延长悬液式生物指示剂的保存时间，同时不影响芽孢的恢复生长。
18.本发明取三组保护剂，编号1、2、3号。三组保护剂均包含于1l基础培养基中，其中基础培养基中包括10.0g/l蛋白胨，5.0g/l葡萄糖及0.012g/l溴甲酚紫。三组保护剂具有保护作用组份如下表1。
19.表1各保护剂的保护组分及其浓度分配培养基编号蔗糖l-谷氨酸钠酪蛋白甘油硫代硫酸钠15.0g/l1.0g/l20.0g/l5.0ml/l1.0g/l210.0g/l5.0g/l5.0g/l10.0ml/l2.0g/l35.0g/l5.0g/l25.0g/l10.0ml/l1.0g/l将上述含保护剂培养基灭菌后置于生物安全柜，以2ml每个分装试管并接入嗜热脂肪地芽孢杆菌atcc7953的芽孢悬液并使其终浓度为1.5*106cfu/ml，即为含保护剂的生物指示剂。
20.对所述悬液在2-8℃低温下保藏不同时间，取出后98℃下热激15min后，将其于梯度稀释加到tsa平板培养基中涂布并于55℃下恒温培养形成菌落并计数。
21.经湿热灭菌抗力仪灭菌处理以测定低温下不同保藏时间的d值变化。
22.保护剂的存在对芽孢悬液保存效果及性能测试结果如下：按照上述1-3号配方制备保护剂，湿热灭菌，分装试管，每管添加50cfu的嗜热脂肪地芽孢杆菌(atcc7953)芽孢，55℃培养48h，观察培养基颜色的变色情况，黄色表示正常生长，紫色表示不生长，结果如表2所示，所有培养基显示黄色，说明微生物能正常恢复生长，培养基不会抑制微生物的恢复生长。
23.表2芽孢悬液低温保存保护剂对嗜热脂肪地芽孢杆菌atcc7953的恢复生长影响
(48h)。
24.上述1-3号作为样品，不加保护剂的基础培养液(只含溴甲酚紫蛋白胨水培养基和芽孢悬液)作为对照组，按照上述芽孢悬液生物指示剂的制备流程及测定指标进行制备和检测，每1个月进行芽孢总数及d值变化检测结果比对，连续检测12个月，检测结果如表3、表4、图1、图2所示。
25.表3优选培养基对芽孢总数变化的影响
注：芽孢数的单位为：*104cfu/ml；存活率＝(冷藏后活菌数/冷藏前活菌数)*100％，单位为：％；1，2，3号分别为不同优选培养基；对照是不添加任何保护剂的芽孢悬液。冷藏前芽孢活菌数为150*104cfu/ml(下同)。
26.表4优选培养基对d值变化的影响检测时间1号2号3号对照
1月1.651.631.561.582月1.581.751.661.623月1.611.701.691.534月1.561.821.721.575月1.541.651.691.616月1.571.691.621.597月1.521.581.611.518月1.601.621.631.409月1.541.711.621.3510月1.571.661.591.1311月1.521.591.520.9812月1.491.551.510.82对比配方1-3号和对照组这4种培养基的检测结果证明：表1检测结果显示三种保护剂培养基在48h时均变成黄色，说明保护剂的添加对芽孢的恢复生长无影响；培养基经过两次灭菌模拟悬液式生物指示剂的工作条件，结果也显示对芽孢的恢复生长无影响。
27.表3检测结果说明芽孢悬液生物指示剂保护剂种类及浓度不同时，其对芽孢悬液在低温条件下的储藏时间及芽孢存活率也存在一定差异。含保护剂培养基均有较好的保护作用。当悬液式生物指示剂在低温条件下储存9个月时，芽孢悬液仍保持原有的芽孢总数，保存至12个月时，芽孢总数保持有65.3％和78％的存活率，相较于不加任何保护剂的空白对照延长了3个月的货架期。其中3号保护剂培养基保护效果最优，在低温条件下储存12个月时，其芽孢存活率仍能达到94.7％。
28.表4检测结果说明保护剂能够较好地维持d值的稳定。含保护剂培养基的芽孢悬液，其d值均在1.5min上下波动，而不加任何保护剂的空白对照在保存至8个月后，d值急剧下降。
附图说明
29.图1优选培养基对芽孢总数变化的影响。
30.图2优选培养基对d值变化的影响。
具体实施方式
31.一种悬液式生物指示剂保护剂。
32.实施案例1，包括基础培养基及添加于基础培养基内中具有保护作用组份，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5-5.0％(w/v)、l-谷氨酸钠0.1-1.0％(w/v)、酪蛋白0.5-5.0％(w/v)、甘油0.5-2.0％(v/v)、硫代硫酸钠0.01-2.0％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
33.实施案例2，包括基础培养基及添加于基础培养基中具有保护作用组份，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5％(w/v)、l-谷氨酸钠0.1％(w/v)、酪蛋白0.5％(w/v)、甘油0.5％(v/v)、硫代硫酸钠0.01％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述
的保护剂ph值为7.2。
34.实施案例3，包括基础培养基及添加于基础培养基中具有保护作用组份，所述的具有保护作用组份包括蔗糖5.0％(w/v)、l-谷氨酸钠1.0％(w/v)、酪蛋白5.0％(w/v)、甘油2.0％(v/v)、硫代硫酸钠2.0％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
35.实施案例4，包括基础培养基及添加于基础培养基中具有保护作用组份，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5％(w/v)、l-谷氨酸钠1.0％(w/v)、酪蛋白5.0％(w/v)、甘油0.5％(v/v)、硫代硫酸钠0.01％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
36.实施案例5，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5-4.5％(w/v)、l-谷氨酸钠0.1-0.8％(w/v)、酪蛋白0.5-4.6％(w/v)、甘油0.5-1.8％(v/v)、硫代硫酸钠0.01-1.9％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
37.实施案例6，所述的具有保护作用组份包括蔗糖4.5％(w/v)、l-谷氨酸钠0.8％(w/v)、酪蛋白4.6％(w/v)、甘油1.8％(v/v)、硫代硫酸钠1.9％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
38.实施案例7，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5％(w/v)、l-谷氨酸钠0.7％(w/v)、酪蛋白4.6％(w/v)、甘油1.8％(v/v)、硫代硫酸钠1.9％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
39.实施案例8，所述的具有保护作用组份包括蔗糖4.0％(w/v)、l-谷氨酸钠0.5(w/v)、酪蛋白0.6％(w/v)、甘油0.8％(v/v)、硫代硫酸钠0.09％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
40.实施案例9，所述的具有保护作用组份包括蔗糖1.0-4.5％(w/v)、l-谷氨酸钠0.5-0.8％(w/v)、酪蛋白0.5-2.5％(w/v)、甘油0.5-1.0％(v/v)、硫代硫酸钠0.1-0.2％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
41.实施案例10，所述的具有保护作用组份包括蔗糖1.0％(w/v)、l-谷氨酸钠0.5％(w/v)、酪蛋白2.5％(w/v)、甘油0.8％(v/v)、硫代硫酸钠0.8％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
42.实施案例11，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5％(w/v)、l-谷氨酸钠1.0％(w/v)、酪蛋白2.0％(w/v)、甘油0.5％(v/v)、硫代硫酸钠0.1％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
43.实施案例12，所述的具有保护作用组份包括蔗糖1.0％(w/v)、l-谷氨酸钠0.5％(w/v)、酪蛋白0.5％(w/v)、甘油1.0％(v/v)、硫代硫酸钠0.2％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。
44.实施案例13，所述的具有保护作用组份包括蔗糖0.5％(w/v)、l-谷氨酸钠0.5％(w/v)、酪蛋白2.5％(w/v)、甘油1.0％(v/v)、硫代硫酸钠0.1％(w/v)，所述的基础培养基为溴甲酚紫蛋白胨水溶液。所述的保护剂ph值为7.2。