一株实现耐盐发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

一株实现耐盐发酵生产
γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物学、生物工程发酵技术领域，具体是涉及一株实现耐盐发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamicacid，γ-pga)是一种多聚氨基酸类多功能性环保型生物可降解高分子材料，分子量一般在10～1000kda左右。γ-pga具有一些独特的物理、化学和生物学特性如良好的水溶性、超强的吸附性、能彻底自然降解和生物降解、对环境无毒无害、可食用等，在工业上可作为诸如增稠剂、保水剂、重金属吸附剂、絮凝剂、药物/肥料缓释剂及药物载体等的原料，应用于食品、化妆品，农业、环保，医药、合成纤维和涂膜等领域。随着人们环保意识的增强，γ-pga的研究和应用越来越受到世界各国学术界的关注，已成为生物降解高分子材料的研究热点之一。
3.目前，微生物发酵法是工业生产中普遍采用的最佳γ-pga制备方法，通过菌种筛选、培养和分离纯化制得γ-pga，工艺简单、条件温和，可进行大规模生产。有研究表明nacl浓度的提高有助于降低γ-pga的黏度，可能会提高发酵体系的传氧、传质速率，从而促进γ-pga的合成，但γ-pga产率比较低。由于钠离子对菌株的聚谷氨酸合成酶类有抑制作用，高浓度的钠离子能置换菌种膜系统结合的钙离子导致na
+
/ca
+
比例增加，从而影响γ-pga产率。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提出一株实现耐盐发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用，实现高产发酵生产γ-pga的同时，适应高盐环境发酵γ-pga。
5.本发明从咸鱼制品中筛选得到一株实现耐盐发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，分类学命名为枯草芽孢杆菌yzhy21.a05(bacillus subtilis yzhy21.a05)，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：62050，保藏日期为2021年11月9日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮政编号510070。
6.本发明还提出了一株该枯草芽孢杆菌在耐盐发酵生产γ-聚谷氨酸的应用。
7.本发明还提出了一株将枯草芽孢杆菌yzhy21.a05接种于发酵培养基中进行发酵，制备γ-聚谷氨酸的技术方案。
8.进一步地，所述发酵培养基为大豆培养基。
9.作为本发明的优选技术方案，利用枯草芽孢杆菌实现耐盐发酵生产γ-聚谷氨酸的方法为：
10.(1)菌体活化：将枯草芽孢杆菌斜面从4℃冷藏柜中取出，置于28℃培养箱活化2～6h；
11.(2)固体发酵：取适当步骤(1)中的菌种斜面，在无菌的条件下，每支斜面以5ml12％、16％以及24％无菌盐水将斜面菌苔清洗下来，以1～4％的接种量接入大豆培养基，恒温发酵24～48h，发酵温度28℃～35℃；
12.(3)提取γ-聚谷氨酸：往发酵24～48h后的大豆培养基中加入无菌水，调节ph至7.0～8.0，震荡15min，滤液离心，去除菌体及少量大豆残渣后得到上清液，上清液加入适量乙醇进行沉淀，最后收集沉淀，将沉淀物烘干至恒重，即得到γ-聚谷氨酸；
13.(4)制备γ-聚谷氨酸凝胶渗透色谱(gpc)样品：取步骤(3)收集样品滤液，离心后采用95％无水乙醇提取，60℃低温烘干得到纯净的γ-聚谷氨酸(γ-pga)，溶解于3mol/l的硫酸钠溶液。
14.进一步优选地，步骤(3)中所采用的乙醇和上清液的体积比为2～4∶1，乙醇的质量分数为95％。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：
16.本发明从咸鱼制品中筛选得到一种实现高盐发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，通过菌种活化、固体发酵、纯化提取三个步骤发酵提取γ-聚谷氨酸，既可实现发酵γ-聚谷氨酸，并且可适应发酵过程高盐碱环境。
附图说明
17.图1是本发明耐盐枯草芽孢杆菌菌株16srdna序列构建所得的系统进化树。
18.图2是本发明耐盐枯草芽孢杆菌与市售日产高桥纳豆素发酵聚谷氨酸含量对比柱状图。
19.图3是本发明耐盐(12％)枯草芽孢杆菌凝胶渗透色谱(gpc)色谱图。
具体实施方式
20.实施例1
21.菌株的分离筛选：
22.分离筛选包括如下步骤：
23.(1)菌体富集：取1g市售咸鱼制品加入nacl浓度为12％的营养肉汤培养基(装液量20ml/250ml三角瓶)，在80℃条件下水浴加热20min，摇床震荡培养24h(30℃，150r/min)。
24.(2)初筛：取步骤(1)中的富集液1ml加入9ml无菌水中获得10-1
样品稀释液，如此方法依次得到不同梯度稀释液。各梯度稀释液分别取0.1ml涂布于营养琼脂平板中，在35℃的恒温条件下培养24h。
25.(3)分离纯化：挑选生长速度快、菌落大、表面黏稠的菌株至对应平板，进一步分离纯化。
26.(4)复筛：将分离纯化得到的菌株接种到大豆固体培养基(装豆量：50g大豆/300ml三角瓶)中，在35℃的恒温条件下，静置发酵48h。将筛选的菌株接入大豆中，观察分析产γ-pga情况，得到一株耐盐性较好、产γ-pga表现优异的菌株进行扩大培养、保存。
27.实施例2
28.菌株的鉴别：
29.利用细菌基因组dna提取试剂盒提取复筛获得菌株的dna，以上游引物27f和下游
引物1492r pcr扩增16s rrna。将扩增后产物胶回收纯化，送至广州艾基生物技术有限公司进行基因测序。
30.测序结果表明，该菌株的16s rrna基因的长度为1400bp(序列如seq id no.1所示)。将测序结果与ncbi数据库进行比对，即可获知与该细菌的16s rdna序列同源性最高的已知序列。通过比对可知，如图1所示bacillus subtilis的相似性最高。因此，可以认定本发明分离筛选的是枯草芽孢杆菌，具体命名为枯草芽孢杆菌yzhy21.a05(bacillus subtilis yzhy21.a05)。
31.实施例3
32.利用枯草芽孢杆菌实现耐盐发酵生产γ-pga
33.(1)菌体活化：枯草芽孢杆菌斜面从4℃冷藏柜中取出，置于28℃培养箱活化2h。
34.(2)固体发酵：取适当步骤(1)中的菌种斜面，在无菌的条件下，每支斜面以5ml12％、16％以及24％无菌盐水将斜面菌苔清洗下来，以4％的接种量接入黄豆培养基(装豆量：50g湿黄豆/300ml三角瓶)，恒温发酵48h，发酵温度30℃。
35.(3)提取γ-聚谷氨酸：往发酵48h的黄豆培养基中加入无菌水，调节ph至7.0～8.0，震荡15min，过滤。滤液离心(8000r/min，5min，25℃)，去除菌体及少量黄豆残渣后得到上清液。上清液加入95％乙醇(1∶3＝v∶v)进行沉淀，最后收集沉淀，将沉淀物烘干至恒重，即得到γ-pga。
36.对比实施例
37.通过对比筛选枯草芽孢杆菌yzhy21.a05与市售高桥纳豆粉产γ-聚谷氨酸产量在不同nacl浓度对比，在nacl浓度为12％环境下发酵48h，两者产γ-聚谷氨酸产量几乎相同；nacl浓度为16％、24％时，高桥发酵情况稍优于枯草芽孢杆菌yzhy21.a05，同时枯草芽孢杆菌yzhy21.a05菌种表现较为优异，存在高盐碱环境下发酵优化的潜力。具体请参阅图2所示。
38.实施例4
39.枯草芽孢杆菌yzhy21.a05产γ-pga分子量测定：
40.筛选得到的枯草芽孢杆菌分别采用nacl浓度为12％、16％、24％盐水制成孢子悬浮液，接种至大豆固体培养基(装豆量：50g大豆/300ml三角瓶)中，发酵48h，将发酵产物溶解无菌水中，离心后加入三倍体积的95％无水乙醇，高速离心5min；经过上述操作后，低温烘干得到较为纯净的γ-pga，采用凝胶渗透色谱(gpc)对γ-pga数均分子量测定，本次使用凝胶渗透色谱(gpc)标准曲线为y＝－1.57468*x+18.7684(相关因子：0.99954616)。
41.结果显示，nacl浓度为12％、16％和24％发酵的γ-pga数均分子量均在480000～530000之间。nacl浓度为12％时，发酵得到的γ-pga数均分子量为480901(如图3所示)。nacl浓度为16％和24％时，发酵得到的γ-pga数均分子量分别为491061和521320。
42.以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。