1.本发明涉及天然产物提取领域，具体涉及一种吴茱萸多糖的提取方法。
背景技术：
2.吴茱萸(evodiaefructus)，又名吴萸、茶辣、漆辣子等，是芸香科植物吴茱萸的干燥成熟果实。通常分大花吴茱萸、中花吴茱萸和小花吴茱萸等几个品种。生于平地至海拔1500米山地疏林或灌木丛中，多见于向阳坡地，全国各地有小或大量栽种。吴茱萸始载于《神农本草经》，具有悠久的用药历史，能用于治疗厥阴头痛、胸腹胀满、恶心呕吐、胃腹寒痛等症状。
3.吴茱萸富含多种生物活性成分，包括生物碱、柠檬苦素、萜类、黄酮、香豆精、甾体、挥发油、木脂素、多糖等。其中，生物碱包括吴茱萸碱、脱氢吴茱萸碱、吴茱萸次碱等得到国内外研究者的广泛报道。但是，作为吴茱萸的主要活性物质之一，关于吴茱萸多糖的报道相对较少。目前，仅有少量关于吴茱萸多糖的提取和生物活性方面的研究。现代研究指出，吴茱萸多糖具有抗氧化作用和抗胃溃疡功效。可见，加大吴茱萸中多糖物质的开发与利用具有重要的理论意义。
4.目前，吴茱萸多糖的提取方法，吴茱萸多糖提取得率不高、生物活性差且单一，很大程度上造成原料的浪费。
技术实现要素：
5.本发明的目的是为了克服现有技术存在的吴茱萸多糖提取得率不高、生物活性差单一的问题，提供一种吴茱萸多糖的提取方法，该方法具有吴茱萸多糖提取得率高的特点。
6.为了实现上述目的，本发明提供一种吴茱萸多糖的提取方法，该方法包括：
7.a、将吴茱萸原料粉碎、醇提、分离沉淀、干燥，得到吴茱萸粉末；
8.b、将所述吴茱萸粉末与蒸馏水混合提取，分离提取液得到第一滤液和第一残渣；
9.c、将所述第一滤液经第一浓缩、沉淀、洗涤、复溶、脱除蛋白质、第二浓缩、透析、第三浓缩、干燥，得到吴茱萸多糖a；
10.d、将所述第一残渣与酸溶液或碱溶液混合提取，分离提取液得到第二滤液和第二残渣；
11.e、将所述第二滤液经第一浓缩、沉淀、洗涤、复溶、脱除蛋白质、第二浓缩、透析、第三浓缩、干燥，得到吴茱萸多糖b。
12.通过上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
13.采用本发明方法对吴茱萸进行多糖的提取，不仅多糖得率高，还能够得到具有不同生物活性的吴茱萸多糖。
具体实施方式
14.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或
值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
15.本发明提供一种吴茱萸多糖的提取方法，该方法包括：
16.a、将吴茱萸原料粉碎、醇提、分离沉淀、干燥，得到吴茱萸粉末；
17.b、将所述吴茱萸粉末与蒸馏水混合提取，分离提取液得到第一滤液和第一残渣；
18.c、将所述第一滤液经第一浓缩、沉淀、洗涤、复溶、脱除蛋白质、第二浓缩、透析、第三浓缩、干燥，得到吴茱萸多糖a；
19.d、将所述第一残渣与酸溶液或碱溶液混合提取，分离提取液得到第二滤液和第二残渣；
20.e、将所述第二滤液经第一浓缩、沉淀、洗涤、复溶、脱除蛋白质、第二浓缩、透析、第三浓缩、干燥，得到吴茱萸多糖b。
21.采用本发明方法对吴茱萸进行多糖的提取，不仅多糖得率高，还能够得到具有不同生物活性的吴茱萸多糖且生物活性好。
22.本发明中，所述酸溶液可以是本领域的常规选择，根据本发明一种优选的实施方式，所述酸溶液选自盐酸、硝酸、柠檬酸中的至少一种。通过采用前述优选方案，能够进一步提高吴茱萸多糖的综合提取得率。
23.本发明中，所述碱溶液可以是本领域的常规选择，根据本发明一种优选的实施方式，所述碱溶液选自氢氧化钠溶液、碳酸氢钠中的至少一种。通过采用前述优选方案，能够进一步提高吴茱萸多糖的综合提取得率。
24.本发明中，只要能够实现本发明的目的，对所述酸溶液中氢离子的浓度没有特别限制，根据本发明一种优选的实施方式，所述酸溶液中氢离子的浓度为0.1-1.5mol/l，优选为0.1-0.5mol/l。通过采用前述优选方案，能够进一步提高吴茱萸多糖的综合提取得率和生物活性。
25.本发明中，只要能够实现本发明的目的，对所述碱溶液中氢氧根离子的浓度没有特别限制，根据本发明一种优选的实施方式，所述碱溶液中氢氧根离子的浓度为0.1-1.5mol/l，优选为0.1-0.5mol/l。通过采用前述优选方案，能够进一步提高吴茱萸多糖的综合提取得率和生物活性。
26.本发明中，只要能够实现本发明的目的，对所述吴茱萸原料的产地没有特别要求，根据本发明一种优选的实施方式，所述吴茱萸原料的产地选自江西、贵州、湖北、湖南中的至少一种。通过采用前述优选方案，能够进一步提高吴茱萸多糖的综合提取得率。
27.本发明中，所述步骤a中醇提的条件可以是本领域的常规选择，根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤a中醇提的条件包括：粉碎后的吴茱萸原料与醇的质量比为1:5-1:50g/ml，醇的质量分数为75％-100％，时间为6h-48h。通过采用前述优选方案，能够尽可能除去吴茱萸中的脂质、色素等干扰成分。
28.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤b中混合提取的条件包括：吴茱萸粉末的质量用量与蒸馏水或酸溶液或碱e液的体积用量的比为1:5-50(g/ml)，温度为30-100℃，时间为0.5-3h。通过采用前述优选方案，能够进一步提高吴茱萸多糖的综合提取得率。
29.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤b中分离包括滤网过滤和离心过滤，其
中，滤网过滤的条件包括：滤网为40-400目滤网；离心过滤的条件包括：转速为3000-8000r/min时间为5-20min。
30.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤b中，将所述第一残渣与吴茱萸粉末做相同处理，分离得到的滤液并入第一滤液中。
31.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤c或步骤e中第一浓缩的条件为：将第一滤液浓缩至原体积的1/10～1/5，优选浓缩方式为减压浓缩。
32.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤c或步骤e中沉淀的方式为醇沉淀法，条件包括：往浓缩液中加入质量分数至少95％的醇直至体系中醇的质量分数为60-90％，温度为20～30℃，时间为12h以上。通过采用前述优选方案，能够进一步提高吴茱萸多糖的综合提取得率。
33.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤c或步骤e中洗涤的条件包括：沉淀采用质量分数依次升高的醇浸泡洗涤至少两次，每次时间为5-20min，所述醇的质量分数至少为70％。通过采用前述优选方案，能够除去色素等小分子物质，进一步提高吴茱萸多糖的综合提取得率。
34.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤c或步骤e中复溶的条件包括：溶剂选自蒸馏水、弱酸溶液、弱碱溶液中的至少一种，温度为20～30℃。
35.所述脱除蛋白质的方式为sevag法或三氟乙酸法。
36.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤c或步骤e中第二浓缩的条件包括：将脱除蛋白质的溶液浓缩至原体积的1/10～1/5，优选浓缩方式为减压浓缩。
37.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤c或步骤e中透析的条件包括：透析袋相对截留分子量为3500-8000da，依次用流动自来水透析12-36h、蒸馏水透析12-36h。通过采用前述优选方案，能够进一步除去单糖、低聚糖等小分子物质，进一步提高吴茱萸多糖的综合提取得率。
38.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤c或步骤e中第三浓缩的条件包括：将透析液浓缩至原体积的1/10～1/5，优选浓缩方式为减压浓缩。
39.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤c或步骤e中干燥的方式为冷冻干燥，条件包括：温度为-50～-80℃，时间为36-72h。
40.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤d中混合提取的条件包括：第一残渣的质量用量与酸溶液或碱e液的体积用量的比为1:5-50(g/ml)，温度为30-100℃，时间为0.5-3h。通过采用前述优选方案，能够将吴茱萸中不易溶出的多糖浸提出。
41.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤d中分离包括滤网过滤和离心过滤，其中，滤网过滤的条件包括：滤网为40-400目滤网；离心过滤的条件包括：转速为3000-8000r/min，时间为5-20min。
42.根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤d中将所述第二残渣与第一残渣做相同处理，分离得到的滤液并入第二滤液中。
43.根据本发明一种优选的实施方式，所述吴茱萸多糖a在浓度范围为0.125-4mg/ml范围内，对abts自由基的清除百分率为8.23-98.18％，对dpph自由基的清除百分比为48.04-91.79％，对o
2-自由基的清除百分率为0-13.35％％，对oh自由基的清除百分比为16.41-82.89％，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为37.24-84.64％。
44.根据本发明一种优选的实施方式，当所述第一残渣与酸溶液混合提取时，所述吴茱萸多糖b在0.125-4mg/ml浓度范围内，对abts自由基的清除百分率为0-7.33％，对dpph的清除百分比为2.71-30.21％，对o
2-的清除百分率为25.54-34.25％，对oh自由基的清除百分比为10.75-76.35％，对α-葡萄糖苷酶活性无抑制作用。
45.根据本发明一种优选的实施方式，当所述第一残渣与碱溶液混合提取时，所述吴茱萸多糖b在0.125-4mg/ml浓度范围内，对abts自由基的清除百分率为14.30-99.40％，对dpph的清除百分比为59.37-83.38％，对o
2-的清除百分率为35.02-100.00％，对oh自由基的清除百分比为46.03％-100.00％。对α-葡萄糖苷酶的抑制率为0-40.85％。
46.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
47.(a)5种吴茱萸多糖的得率测定：将冻干后的吴茱萸多糖称重，以提取原料质量分别计算其得率：
48.吴茱萸多糖的多糖得率＝(吴茱萸多糖的多糖质量/提取原料质量)
×
100％；
49.(b)5种吴茱萸多糖的自由基清除能力测定：
50.ⅰ
)对abts自由基清除能力的测定方法：取20ml 7mmol/l的abts溶液，加入352μl140mmol/l的过硫酸钾，在室温下至于暗处反应12～16h，形成abts自由基储备液。在734nm处，用70％(v/v)乙醇稀释abts自由基储备液至吸光度为0.7
±
0.02。准确量取0.125、0.25、0.5、1、2、4mg/ml的多糖各0.1ml，加入3.9ml abts溶液混匀，在室温下反应6min于734nm处测吸光度。以vc为阳性对照。多糖清除abts自由基的计算公式为：清除率(％)＝[(a
2-a1)/a2]
×
100，a1和a2分别为多糖+abts和70％(v/v)乙醇+abts的吸光度；
[0051]
ⅱ
)对dpph自由基清除能力的测定：往0.5ml不同浓度(0.125、0.25、0.5、1、2、4mg/ml)的多糖溶液加入2.0ml 0.1mmol/l dpph溶液(由无水乙醇配制)和1.5ml蒸馏水，充分混匀后在暗处于室温环境下反应30min，反应完毕后于517nm处测定吸光度值。以bht为阳性对照。多糖清除dpph自由基的计算公式为：清除率(％)＝[1-((a
2-a1)/a0]
×
100，a0、a1和a2分别为蒸馏水+dpph、多糖+无水乙醇和多糖+dpph的吸光度；
[0052]
ⅲ
)对oh自由基清除能力的测定：1.0ml不同浓度(0.125、0.25、0.5、1、2、4mg/ml)的多糖溶液、1.0ml 2mmol/l feso4和1.0ml6mmol/l水杨酸-乙醇溶液充分混匀。往其中加入1.0mlh2o2溶液后，在37℃条件下于暗处反应60min。反应完毕后于510nm处测定吸光度值。以vc为阳性对照。多糖清除oh自由基的计算公式为：清除率(％)＝[(1-a1+a2)/a0]
×
100，a0、a1和a2分别为空白对照(无多糖)、多糖测试样品和多糖水溶液(无h2o2)的吸光度值；
[0053]
ⅳ
)对o
2-自由基清除能力的测定：4.5ml 50mmol/l tris-hcl缓冲液和2.0ml蒸馏水加至测试管中后于25℃孵育20min。随后，2.0ml不同浓度(0.125、0.25、0.5、1、2、4mg/ml)的多糖溶液和0.5ml 25.0mmol/l邻苯三酚加至测试管中，充分混匀后于25℃反应60min。加入1.0ml 10mmol/l hcl溶液终止反应，于320nm处测定吸光度值。以vc为阳性对照。多糖清除o
2-·
自由基的计算公式为：清除率(％)＝[(a
0-a1+a2)/a0]
×
100，a0、a1和a2分别为空白对照(蒸馏水替代多糖样品)、多糖测试样品和多糖水溶液(蒸馏水替代邻苯三酚)的吸光度值；
[0054]
(c)5种吴茱萸多糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用评估：往40μl不同浓度(0.125、0.25、0.5、1、2、4mg/ml)的多糖溶液(经ph＝6.8，0.2mol/l pbs溶液配制)中加入40μl 0.45u/lα-葡萄糖苷酶。混匀充分后，于37℃孵育10min。随后，往混合物中加入80μl 5mmol/l pnpg溶
液，混匀后于37℃反应20min。加入100μl 0.2mol/l碳酸钠溶液终止反应，于405nm处测定吸光度值。以阿卡波糖为阳性对照。多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝[1-(a
1-a2)/(a
3-a0)]
×
100，a0、a1、a2和a3分别为pbs缓冲液+pnpg溶液(无α-葡萄糖苷酶)、多糖+pnpg溶液+α-葡萄糖苷酶、多糖+pnpg溶液(无α-葡萄糖苷酶)和pbs缓冲液+pnpg溶液+α-葡萄糖苷酶的吸光度值。
[0055]
实施例1
[0056]
以干燥吴茱萸(江西樟树产)为原料，经粉碎机粉碎得到粉末；向吴茱萸粉末中加入15倍质量的质量分数为95％的乙醇浸泡24h，4层纱布过滤，收集沉淀、挥干乙醇，所得吴茱萸粉末备用。吴茱萸粉末与蒸馏水混合，重量/体积(g/ml)比为1:15，沸水浴提取1.5h，将提取液依次用纱布(200目)过滤、4800r/min离心分离15min，收集滤液和残渣；残渣再次提取，提取液再次经纱布过滤、4800r/min离心分离15min得到滤液。合并两次提取所得滤液，并收集残渣。滤液用于吴茱萸多糖的制备，滤液经减压浓缩至原体积1/5，往浓缩液中缓慢加入无水乙醇(边加边搅拌)，直至体系中乙醇质量分数为80％，室温(20～30℃)静置12h以上，4800r/min离心分离15min收集沉淀。沉淀依次添加质量分数为70％、90％和100％的乙醇(各洗涤10min)，浸泡洗涤后于室温20～30℃复溶(溶剂为蒸馏水)，采用sevag法除去蛋白质。脱除蛋白质的多糖溶液减压浓缩至原体积的1/10，将浓缩液进行透析(透析袋相对截留分子量为3500da)，依次用流动自来水透析24h、蒸馏水透析36h。透析结束后，将透析液浓缩至原体积的1/5、冷冻干燥(温度为-80℃，时间为72h)，得到吴茱萸多糖。所得吴茱萸多糖的得率为5.0％，在0.125-4mg/ml浓度范围内，其清除abts、dpph、oh和o
2-自由基的百分率分别为8.23-98.18％、48.04-91.79％、16.41-82.89％、和0-13.35％，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为37.24-84.64％；
[0057]
以吴茱萸经水提后所得残渣为原料，吴茱萸残渣与0.5mol/l hcl溶液混合，重量/体积(g/ml)比为1:15，沸水浴提取1.5h，将提取液依次用纱布过滤、4800r/min离心分离15min，收集滤液和残渣；残渣再次提取，提取液再次经纱布过滤、4800r/min离心分离15min得到滤液。合并两次提取所得滤液，并收集残渣。滤液用于吴茱萸多糖的制备，滤液经减压浓缩至原体积1/5，往浓缩液中缓慢加入无水乙醇(边加边搅拌)，直至体系中乙醇质量分数为80％，室温(20～30℃)静置12h以上，4800r/min离心分离15min收集沉淀。沉淀依次添加质量分数为70％、90％和100％的乙醇(各洗涤10min)，浸泡洗涤后于室温20～30℃复溶(溶剂是蒸馏水)，采用sevag法除去蛋白质。脱除蛋白质的多糖溶液减压浓缩至原体积的1/10，将浓缩液进行透析(透析袋相对截留分子量为3500da)，依次用流动自来水透析24h、蒸馏水透析36h。透析结束后，将透析液浓缩至原体积的1/5、冷冻干燥(温度为-80℃，时间为72h)，得到吴茱萸多糖。所得吴茱萸多糖的得率为2.0％，其在0.125-4mg/ml浓度范围内，其清除abts、dpph、oh和o
2-自由基的百分率分别为0-7.33％、2.71-30.21％、10.75-76.35％和25.54-34.25％，其对α-葡萄糖苷酶无抑制作用。
[0058]
实施例2
[0059]
同实施例1，不同在于，以吴茱萸经水提后所得残渣为原料，吴茱萸残渣与0.5mol/l的naoh溶液混合，得到吴茱萸多糖。所得吴茱萸多糖的得率为17.4％，在0.125-4mg/ml浓度范围内，其清除abts、dpph、oh和o
2-自由基的百分率分别为14.30-99.40％、59.38-83.38％、46.04-100.00％和35.02-100.00％，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为0-40.85％。
[0060]
实施例3
[0061]
同实施例2，不同在于，吴茱萸残渣与氢氧根离子浓度为0.25mol/l的碳酸氢钠溶液混合，得到吴茱萸多糖。吴茱萸多糖的得率为18.2％，在0.125-4mg/ml浓度范围内，其清除abts、dpph、oh和o
2-自由基的百分率分别为14.42-99.10％、59.88-83.01％、46.54-100.00％和36.21-100.00％，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为0-40.13％。
[0062]
实施例4
[0063]
同实施例1，不同在于吴茱萸残渣与氢离子浓度为0.1mol/l的柠檬酸溶液混合，得到吴茱萸多糖。吴茱萸多糖的得率为2.0％，其在0.125-4mg/ml浓度范围内，其清除abts、dpph、oh和o
2-自由基的百分率分别为0-7.15％、2.92-30.03％、10.81-76.18％和25.63-34.01％，其对α-葡萄糖苷酶无抑制作用。
[0064]
实施例5
[0065]
同实施例1，不同在于吴茱萸残渣与1.5mol/l hcl溶液混合，吴茱萸多糖的得率为1.0％，在0.125-4mg/ml浓度范围内，其清除abts、dpph、oh和o
2-自由基的百分率分别为0-5.33％、1.61-20.20％、4.59-73.11％和17.53-24.25％，其对α-葡萄糖苷酶无抑制作用。
[0066]
实施例6
[0067]
同实施例2，不同在于吴茱萸残渣与1.5mol/l氢氧化钠溶液混合，吴茱萸多糖的得率为10％。在0.125-4mg/ml浓度范围内，其清除abts、dpph、oh和o
2-自由基的百分率分别为9.50-99.30％、29.58-72.32％、40.25-100.00％和29.38-100.00％，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为0-30.65％。
[0068]
对比例1
[0069]
同实施例1，不同在于，吴茱萸粉末直接经0.5mol/l hcl进行提取，得到吴茱萸多糖。所得吴茱萸多糖的得率为3.0％，在0.125-4mg/ml浓度范围内，其清除abts、dpph、oh和o
2-自由基的百分率分别为0-5.06％、1.54-18.49％、4.31-71.25％和16.45-19.71％，对α-葡萄糖苷酶活性无抑制作用。
[0070]
对比例2
[0071]
同实施例1，不同在于，吴茱萸粉末直接经0.5mol/l naoh进行提取，得到吴茱萸多糖。所得吴茱萸多糖的得率为19.5％，在0.125-4mg/ml浓度范围内，其清除abts、dpph、oh和o
2-自由基的百分率分别为7.30-99.34％、26.97-43.90％、28.00-100.00％和39.90-93.71％，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为0-27.16％。
[0072]
综上，采用本发明方法对吴茱萸进行多糖的提取，不仅多糖的综合得率高，提高了吴茱萸的利用率，还能够得到具有不同生物活性的吴茱萸多糖a和活性的吴茱萸多糖b，并且，相对于直接使用酸提(对比例1)，采用本发明方法的实施例1，先水提再酸提得到的吴茱萸多糖的生物活性得到显著的提高；相对于直接使用碱提(对比例2)，采用本发明方法的实施例2，先水提再碱提得到的吴茱萸多糖的生物活性得到显著的提高。
[0073]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。