一种抗柯萨奇病毒A6型的单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及抗体，具体涉及一种抗柯萨奇病毒a6型的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、近年来，柯萨奇病毒a组6型(cox-sackievirus a6，cv-a6)引起的手足口病在全球呈上升趋势，在部分国家，cv-a6甚至已取代ev71及cv-a16，成为引发手足口病最主要的病原体。感染cv-a6的手足口病(hand，foot and mouth disease，hfmd)儿童主要表现为发热、皮疹和脱甲。且有研究发现，感染cv-a6的患者出现发热的比例要明显高于感染ev71和cv-a16的患者，平均体温约为38.8℃。成人亦存在感染cv-a6的现象，除出现上述症状的基础外，还会表现出诸如手掌、脚底、口周等部位出疹的现象。上述症状均为常见的hfmd临床表现，并非所有患者均存在上述症状，也存在部分患者呈现无症状感染的情况。目前，对于cv-a6的研究尚不全面，也无相应的疫苗投入使用。目前全球主要流行的cv-a6是重组进化后的变异株。cv-a6也易与其他肠道病毒共同造成混合感染。重组cv-a6病毒感染可能比非重组cv-a6感染导致更广泛的皮肤损害，并且上肢、下肢和前躯干出现的皮肤损害更加频繁。

2、随着基因测序技术的进步，研究发现病毒基因组中的vp1段为编码病毒主要中和表位相关的基因，因此 vp1段的同源性和中和实验的结果呈现高度的相关性。因此，基于病毒基因组vp1段的同源性比对也成为了病毒鉴定分型的金标准之一。目前尚无国际公认的cv-a6基因分型标准。以vp1编码区全基因序列(915bp) 差异＞15％以及亚型间核昔酸差异＞8％为标准，song等(song y,zhang y,ji t,et al.persistent circulation ofcoxsackievirus a6 of genotype d3 in mainland of china between 2008and 2015[j].scientific reports,2017,7(1): 1-11.)将cv-a6分为a、b、c、d四个基因型以及bl和b2、c1和c2、d1、d2和d3基因亚型。其中基因型a包含一个单一菌株，即1949年在美国分离的cva6原型菌株gdula。近年来，cv-a6流行株主要为d2和d3亚型，其中d3亚型及其d3a进化分支更为普遍。

3、研究表明，免疫球蛋白能够较为显著地降低如γ-干扰素、白介素-6、白介素-8等细胞因子的水平。但免疫球蛋白亦会存在诸如广谱性不高、无法中和所有血清型、可能导致感染增强等局限性。目前治疗药物正着力于抗特定病毒的单克隆抗体、对病毒的进入或复制产生抑制的小分子药物等方向的研究。

4、单克隆抗体具有高度靶向性、低毒性等特点，是病毒感染临床诊断和治疗的重要手段，也是现代生命科学的重要工具，广泛应用于临床诊断、治疗及疫苗评价等方面。因此，开发针对cv-a6的单克隆抗体对于该病毒感染的诊断、治疗和疫苗生产具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种抗柯萨奇病毒a6型的抗体及其抗原结合片段以及该抗体及其抗原结合片段的制备方法和应用。

2、具体地，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区cdr1、 cdr2、cdr3具有如seq id no.1-3所示的氨基酸序列，和/或，所述抗体或其抗原结合片段的轻链互补决定区 cdr1、cdr2、cdr3具有如seq id no.4-6所示的氨基酸序列。

4、本发明中，抗原结合片段是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，或者可与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。

5、在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区cdr1、cdr2、cdr3具有如 seq id no.1-3所示的氨基酸序列，轻链互补决定区cdr1、cdr2、cdr3具有如seq id no.4-6所示的氨基酸序列。

6、在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq id no.1-3所示，轻链互补决定区cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq id no.4-6所示。

7、本发明提供的上述抗体或其抗原结合片段同时具有cv-a6特异性和型内广谱性，能够交叉结合及中和 cv-a6不同亚型的毒株。

8、优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有如seq id no.7所示的氨基酸序列或具有与如seq id no.7所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；和/或，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有如seq id no.8所示的氨基酸序列或具有与如seq id no.8所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。

9、在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有如seq id no.7所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seq id no.8所示的氨基酸序列。

10、在本发明的一些实施方式中，在具有上述重链和轻链互补决定区cdr1、cdr2、cdr3的情况下，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与如seq id no.7所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性的氨基酸序列，轻链可变区具有与如seq id no.8所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性的氨基酸序列。

11、在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段在重链可变区的n端还包含信号肽。

12、在本发明的一些实施方式中，在重链可变区的n端的信号肽具有如seq id no.9所示的氨基酸序列。

13、在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段在轻链可变区的n端还包含信号肽。

14、在本发明的一些实施方式中，在轻链可变区的n端的信号肽具有如seq id no.10所示的氨基酸序列。

15、本发明中，所述抗体可为单克隆抗体、双特异抗体或多特异抗体。

16、其中，所述单克隆抗体可为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

17、本发明中，所述抗原结合片段可为fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互补决定区片段或单链抗体。

18、在本发明的一些实施方式中，所述抗体还包含重链恒定区。

19、在本发明的一些实施方式中，所述抗体的重链为igg2b。

20、在本发明的一些实施方式中，所述重链恒定区的氨基酸序列如seq id no.11所示。

21、在本发明的一些实施方式中，所述抗体还包含轻链恒定区。

22、在本发明的一些实施方式中，所述抗体的轻链为kappa。

23、在本发明的一些实施方式中，所述轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no.12所示。

24、第二方面，本发明提供一种标记抗体，其为以上所述的抗体或其抗原结合片段被酶、生物素、荧光染料、化学发光染料和/或放射性同位素标记得到。

25、第三方面，本发明提供一种核酸分子，其编码所述抗体或其抗原结合片段。

26、根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。

27、在本发明的一些实施方式中，编码上述抗体的重链的核酸分子的核苷酸序列如seq id no.13所示，编码上述抗体的轻链的核酸分子的核苷酸序列如seq id no.14所示。

28、第四方面，本发明提供一种生物材料，其含有以上所述的核酸分子；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

29、上述表达盒可为由所述核酸分子与启动子可操作性地连接得到的重组dna。

30、上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。

31、上述宿主细胞包括微生物细胞、动物细胞或细胞系。其中微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母等，动物细胞包括但不限于昆虫细胞，细胞系包括但不限于cho细胞、293t细胞等。

32、第五方面，本发明提供所述抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述方法包括：培养能够表达所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，经分离得到所述抗体或其抗原结合片段。

33、第六方面，本发明提供所述抗体或其抗原结合片段或所述标记抗体或所述核酸分子或所述生物材料的以下任一种应用：

34、(1)在制备用于检测柯萨奇病毒a6型在样品中的存在或其水平的产品中的应用；

35、(2)在制备用于诊断柯萨奇病毒a6型感染或由柯萨奇病毒a6型感染导致疾病的产品中的应用；

36、(3)在制备用于中和样品中的柯萨奇病毒a6型毒力的产品中的应用；

37、(4)在制备用于预防或治疗柯萨奇病毒a6型感染或由柯萨奇病毒a6型感染导致疾病的药物中的应用；

38、(5)在检测柯萨奇病毒a6型疫苗的抗原性和免疫原性中的应用；

39、(6)在柯萨奇病毒a6型疫苗生产的质量控制中的应用；

40、(7)在检测柯萨奇病毒a6型抗原的特异性中的应用。

41、上述(1)所述的应用中，检测柯萨奇病毒a6型在样品中的存在是指检测样品中是否含有柯萨奇病毒a6 型，检测柯萨奇病毒a6型的水平是指检测样品中柯萨奇病毒a6型的含量。

42、上述(1)、(3)所述的应用中，所述样品可以是来自有生命的人或动物的样品(包括血液、排泄物、口鼻分泌物等)，也可以是体外培养的细胞样品。

43、上述(1)、(2)所述的应用中，所述产品可为检测试剂或试剂盒。

44、上述(2)、(4)所述的应用中，由柯萨奇病毒a6型感染导致疾病包括手足口病等。

45、上述(5)所述的应用中，免疫原性检测具体为检测柯萨奇病毒a6型疫苗引起动物机体免疫应答的性能，包括免疫动物体液免疫功能(例如：中和抗体及其水平、抗体的亲和力)的评价等。

46、上述(6)所述的应用中，柯萨奇病毒a6型疫苗的质量控制具体为检测柯萨奇病毒a6型疫苗中抗原质量、含量、稳定性等是否合格。

47、上述应用中，检测的方法可以使用酶联免疫吸附(elisa)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等。本发明提供的抗体或其抗原结合片段可作为上述检测方法中的结合抗体，用于柯萨奇病毒a6型疫苗抗原的检测。

48、第七方面，本发明提供一种试剂盒，其包含所述抗体或其抗原结合片段或所述标记抗体。

49、上述试剂盒具有以下任一种用途：

50、(1)检测柯萨奇病毒a6型在样品中的存在或其水平；

51、(2)诊断柯萨奇病毒a6型感染或由柯萨奇病毒a6型感染导致疾病；

52、(3)检测柯萨奇病毒a6型疫苗的抗原性和免疫原性；

53、(4)柯萨奇病毒a6型疫苗生产的质量控制；

54、(5)检测柯萨奇病毒a6型抗原的特异性。

55、上述试剂盒除包含所述抗体或其抗原结合片段或所述标记抗体外，还可包含携带可检测的标记的第二抗体以检测本发明的抗体或其抗原结合片段。其中，可检测的标记包括但不限于酶、放射性同位素，荧光染料等。

56、第八方面，本发明提供一种药物，其包含所述抗体或其抗原结合片段。

57、上述药物具有以下任一种用途：

58、(1)预防柯萨奇病毒a6型感染或由柯萨奇病毒a6型感染导致疾病；

59、(2)治疗柯萨奇病毒a6型感染或由柯萨奇病毒a6型感染导致疾病。

60、上述药物除包含所述抗体或其抗原结合片段外，还可包含药学上可接受的载体、赋形剂或其他活性成分。

61、第九方面，本发明提供检测柯萨奇病毒a6型在样品中的存在或其水平的方法，所述方法包括，使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测柯萨奇病毒a6型在样品中的存在或其水平。所述方法可以用于诊断目的(样品来自有生命的人或动物)，或者非诊断目的(样品是体外培养的细胞样品，而非来自有生命的人或动物的样品)。

62、第十方面，本发明提供诊断柯萨奇病毒a6型感染或由柯萨奇病毒a6型感染导致疾病的方法，所述方法包括：使用本发明的抗体或其抗原结合片段诊断柯萨奇病毒a6型感染或由柯萨奇病毒a6型感染导致疾病。

63、第十一方面，本发明提供用于中和样品中柯萨奇病毒a6型毒力的方法，所述方法包括，将包含柯萨奇病毒a6型的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触。所述方法可以用于治疗目的或非治疗目的(样品是体外培养的细胞样品，而非来自有生命的人或动物的样品)。

64、第十二方面，本发明提供用于预防或治疗柯萨奇病毒a6型感染由柯萨奇病毒a6型感染导致疾病(包括手足口病等)的方法，所述方法包括：给予受试者预防或治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或其抗原结合片段的药物。

65、第十三方面，本发明提供一种柯萨奇病毒a6型疫苗生产的质量控制方法，所述方法包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测柯萨奇病毒a6型的步骤。

66、本发明的有益效果至少包括以下几方面：

67、(1)本发明提供的抗体或其抗原结合片段兼具cv-a6特异性和型内广谱性，能够特异性结合cv-a6，而与其他型别抗原和vero宿主细胞蛋白无交叉反应；而且还能够交叉结合cv-a6不同亚型的毒株。

68、(2)本发明提供的抗体或其抗原结合片段具有广谱中和活性，能够交叉中和cv-a6不同亚型的毒株。

69、(3)本发明提供的抗体或其抗原结合片段可以竞争抑制人自然感染血清。

70、(4)本发明提供的抗体或其抗原结合片段对cv-a6感染动物具有较好的保护作用，保护效果与抗体剂量呈现效应关系。

71、本发明提供的抗体或其抗原可应用于cv-a6的存在或其含量水平的检测，cv-a6疫苗抗原性及免疫原性的评价，对cv-a6的检测、cv-a6疫苗的研发、评价及临床诊断具有重要意义；还可应用于cv-a6预防或治疗药物的开发，对于cv-a6感染及其相关疾病的治疗具有重要意义。