标记物基因在检测多能干细胞残留中的应用、检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及多能干细胞残留检测，具体涉及标记物基因在检测多能干细胞残留中的应用、检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、再生医学是指利用多种新型技术学科来重建老化或功能损失的组织和器官，并通过多种医学手段来进行相关疾病治疗的新兴科学。再生医学的重要研究方向为正常组织特征与功能的机理，创伤后修复的生物学基础，以及组织器官的再生机制及多种干细胞分化机理，从而最终获得有效的生物治疗方法。其研究方法综合了多种手段，包括生命科学、材料科学，临床医学等学科的原理和方法，综合解决用于替代、修复、重建或再生人体各种组织器官的临床解决方案。

2、在再生医学的发展过程中，有多个核心问题需要解决。理想的再生医学产品，尤其是细胞治疗产品，应该具备以下几个特征：第一，细胞来源必须是单一可无限增殖细胞类型；第二，细胞必须易于进一步的改造，例如使用基因编辑等工具对致病基因进行修正；第三，最终获得的产品性质均一。如何获得可用于细胞治疗的最初细胞来源，是再生医学领域早期的重要研究课题。其中，胚胎干细胞(embryonic stem cell，escs，简称es、ek或esc细胞)是早期再生医学研究中最受人瞩目的细胞类型。胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。但是这一细胞的获得和使用均具有较大的伦理争议，因为进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。这一伦理争议大大阻碍了再生医学的推进和应用。

3、2006年，山中伸弥的团队发明了一种由oct4、sox2、klf4和c-myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(induced pluri potent cells,ipsc)(takahashi k,et al.，cell，2006，126(4)pp.663-676；tak ahashi k and yamanaka s，cell，2007，131(5)pp.861-872)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells)类似的分化潜能，能够形成人体发育最基本的三个胚层：外胚层、中胚层及内胚层，并最终形成多种成体细胞。这一发明突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制，可以解决细胞移植治疗中的免疫排斥问题，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。使用包括胚胎干细胞及多能干细胞在内的全能干细胞或者多能干细胞作为原材料进行外胚层细胞诱导分化可以作为临床治疗的新思路，大大拓展了外胚层细胞在临床医学上的应用潜力。仅在再生医学领域，诱导多能干细胞在即将进入临床阶段的应用已经涉及的领域包括神经退行性疾病，脊髓损伤、i型糖尿病、肿瘤等方向。

4、然而，包括胚胎干细胞及诱导多能干细胞在内的多能干细胞拥有无限增殖的能力，可以在体内形成畸胎瘤。因此，应用于临床的多能干细胞衍生产品中必须剔除多能干细胞残留，保证移植产品的安全性。目前用于监测多能干细胞残留的方法存在诸多缺陷。比如，细胞培养法，在培养待检细胞2周后，然后通过观察残留细胞形成的克隆来判断。这种方法耗时较长，且不能排除多能干细胞自分化产生的假阴性结果。此外，通过流式细胞术检测产品中多能干细胞特有标志物来判断多能干细胞残留的比例，此方法分辨率较低，1％的检测精度限制了其使用范围。目前，较为通用的方法为使用定量pcr或数字pcr检测多能干细胞中特异基因的表达，从而判断多能干细胞的残留比例。但是，当前使用的一些标志基因，如nanog、lin28等，虽然在多能干细胞中表达量较高，但在某些衍生细胞中也具有较高的表达量，因此，这类基因的作为判断多能干细胞残留的标志物并不精确，检测的精度较低(约为0.1％)。

5、tdgf1位于常染色体3p21.3，基因全长2kb或1.7kb，分别包含6个外显子、5个内含子，4个外显子和5个内含子，开放阅读框564bp。tdgf1在胚胎发育阶段起到非常重要的作用，尤其在干细胞更新、多功能型分化和存活方面。在早期胚胎发育阶段egf-cfc蛋白作为必不可少的共同受体转化tgf-β家族蛋白信号，tdgf1与tgf-β家族配体nodal都是胚胎发育的关键调控因子，而且是人类胚胎干细胞未分化的标志，在正常成体组织中表达极少。

6、triml2基因编码类三结构域家族蛋白2(tripartite motif family like 2)。该蛋白可能受抑癌因子p53调控，并可能通过增强p53类泛素化修饰来调控p53。该基因可变剪接导致多个转录本变异。triml2在多能干细胞及其衍生的神经干细胞(neural stemcells,nsc)和多巴胺能前体细胞(dopaminergic progenitor cells,dpc)中表达量差异极大，且其灵敏度高，筛选确定用于多能干细胞残留的鉴定。

7、现有技术中，oct4、nanog、lin28等标志物(sekine k.,et al.,sci rep,2020,10,10293.)用于多能干细胞残留的鉴定，但由于上述基因在ipsc衍生的细胞，如nsc和dpc，中均有较高程度的表达，与ipsc相比表达差异较小，导致其灵敏度低下，用于多能干细胞衍生产品的临床风险较高，在临床使用中的安全性得不到保障。

技术实现思路

1、本发明旨在提出一种标记物基因在检测多能干细胞残留中的应用、检测方法及试剂盒，以至少解决上述现有技术中存在的诸多问题之一。

2、具体地，本发明的方案如下：

3、本发明提出一种标记物基因在检测多能干细胞残留中的应用，其特征在于，所述标记物基因用于对多能干细胞衍生细胞中多能干细胞残留进行检测，所述标记物基因包括tdgf1及triml2中的至少一种。

4、进一步地，所述多能干细胞衍生细胞包括神经干细胞、视神经细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、自然杀伤细胞以及心肌细胞。

5、本发明提供一种多能干细胞残留的检测方法，所述检测方法包括使用tdgf1及triml2中至少一种标记物基因，检测获取多能干细胞的残留量。

6、进一步地，所述检测方法通过定量检测样品中的标记物基因，并与掺有多能干细胞的衍生细胞标准品进行对比，得到多能干细胞残留量。

7、进一步地，所述检测方法包括以下步骤：

8、(1)在多能干细胞衍生细胞中添加不同数量梯度的多能干细胞，作为标准品；

9、(2)根据标记物基因序列设计引物，并将引物和所述标准品通过定量pcr进行反应，制作多能干细胞在其衍生细胞中残留的标准曲线；

10、(3)将待测多能干细胞衍生细胞通过定量pcr进行反应，检测样品中的标记物基因表达量，根据ct值的比较得到多能干细胞细胞残留比例。

11、作为优选，所述标记物基因tdgf1的引物核苷酸序列为seq id no：3或/和seq idno：4。

12、作为优选，所述标记物基因triml2的引物的核苷酸序列为seq id no：5或/和seqid no：6。

13、作为优选，所述步骤(2)中，所述qpcr检测的程序为，预变性95℃120秒；pcr反应，循环数：40次，95℃10秒，58℃20秒；94℃30秒。

14、一种多能干细胞残留的检测试剂盒，其特征在于，包括根据核苷酸序列为seq idno：1或seq id no：2的标记物基因设计的引物。

15、作为优选，所述引物为核苷酸序列为seq id no：3～4或seq id no：5～6的至少一种。

16、相比现有技术，本发明的有益效果为：

17、1.本发明为tdgf1、triml2新的应用，用于检测多能干细胞衍生细胞中的干细胞残留。

18、2.本发明通过全转录组测序的方法筛选出在多能干细胞中高表达，同时在衍生分化细胞中低表达的显著差异基因，通过定量pcr的方法进一步验证方法可靠性并最终确定检测的灵敏度。本方法筛选出的标志物tdgf1、triml2可用于多能干细胞残留的鉴定，与oct4、nanog、lin28等标志物相比，本发明筛选出的标志物由于在ipsc衍生细胞(如nsc和dpc细胞)中本底表达极低，因此其灵敏度远远高于前者，约为0.01％(oct4、nanog、lin28等标志物通常为0.1％)。因此，本发明的检测方法可以大大提高多能干细胞残留的检测精度，从而降低了多能干细胞衍生产品的临床风险，大大拓展了多能干细胞衍生产品在临床使用中的安全性。

19、3.本发明可对针对广泛的多能干细胞衍生细胞中残留多能干细胞进行检测，所述多能干细胞衍生细胞包括神经干细胞、视神经细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、自然杀伤细胞以及心肌细胞等，用于临床细胞产品的质量控制普适性强。