一种辣木抗氧化肽及其制备方法和应用

1.本发明涉及抗氧化肽领域，尤其涉及一种辣木抗氧化肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.辣木(morinfga oleifera lam.)属于辣木科辣木属，是一种多年生热带落叶乔木植物，全球约有14 个品种。原产于印度，是辣木科中生长广泛、价值极高的树种。因其根部具有辛辣味，所以取名“辣木”， 因其树干像鼓槌，又有“鼓槌树”之称。辣木富含营养素，如蛋白质、维生素、矿物元素及活性酶类物 质，因其对各种疾病具有较好的治愈能力，被称之为“奇迹树”、“医药宝箱”等。辣木对土壤条件和 降雨量有很强的适应性，生长迅速，广泛种植于亚洲、非洲的热带和亚热带地区。我国主要种植在海南、 四川、广东、广西和云南等地，其中云南种植辣木面积占全国辣木种植面积的一半以上。
3.辣木全株均可用，是一种具有丰富营养与独特经济价值的热带植物。辣木的蛋白质含量在不同的部 位差异性较大。新鲜的辣木叶100g含6.7g蛋白质，是菠菜(2.8g/100g)的两倍多；干辣木叶粉中的 蛋白质含量最高，100g含27.1g蛋白质，是酸奶中蛋白质含量的9倍；辣木嫩荚中蛋白质含量最低， 100g含2.5g蛋白质。叶是辣木中蛋白含量最高的器官，且已获批新资源食品，因此研究辣木叶中蛋白 质的高质化利用具有重要意义。辣木叶蛋白中，谷蛋白占80％，醇溶蛋白占14％，白蛋白占3.5％，球 蛋白占1％，是一种可与大豆蛋白媲美的优质植物蛋白。与花生、大豆、棉籽等其他植物性蛋白相比， 辣木叶蛋白的生物效价和营养价值均较高，是一种极具开发潜力的优质蛋白。
4.人肝癌细胞(hepg2)具有易于培养及代表性强等特点，所以经常选择化学试剂对hepg2细胞的 氧化损伤模型来评价天然抗氧化剂和植物化学物质对肝脏的保护作用，有文献以hepg2细胞建立氧化 损伤模型，研究了多肽lys-asp-his-cys-his(kdhch)对细胞内抗氧化和凋亡活性的影响，还有文献以 hepg2细胞建立氧化损伤模型，研究玉米1kda蛋白肽组分(cpfs)在hepg2细胞中清除细胞内活性氧 (ros)的能力和抗氧化酶调节能力。目前各国对辣木叶抗氧化研究主要集中于水提物，有文献研究表明 辣木叶提取物对甲氨蝶呤(mtx)治疗引起的氧化应激和肝肾损伤具有保护作用。
5.但辣木叶水提物成分复杂，不能明确有效作用成分，在深入研究和产品开发方面存在一定弊端。故 本发明以辣木叶为原料出发，提取、分离辣木叶抗氧化多肽，研究其对hepg2细胞氧化损伤作用，阐 述清楚辣木叶抗氧化作用成分及抗氧化多肽的作用机制。为生产功能食品和保健类食品提供了理论依据， 加大了辣木的利用度，对辣木生物资源综合利用具有巨大的经济价值和社会效益，有效促进辣木产业及 中国地方经济发展。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供一种辣木抗氧化肽及其制备方法和应用。本发明以辣木叶粉为 原料提取辣木蛋白，并通过酶解技术制备具有抗氧化活性的多肽，利用超滤技术分离，测定不同肽段抗 氧化活性，筛选抗氧化活性较高的目标肽段，并采用质谱技
术对目标肽段进行序列鉴定，分离合成得到 相应的肽段，发现特定的目标肽段体外抗氧化活性均较高，对hepg2细胞氧化损伤具有明显的保护作 用。
7.为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种辣木抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
8.步骤(1)辣木蛋白提取：辣木叶粉溶于水，调节ph值，超声波辅助提取后离心收集上清液，采 用硫酸铵沉淀，离心水洗沉淀，采用透析袋透析，得到辣木蛋白，冷冻干燥；
9.步骤(2)酶解：辣木蛋白溶解调节ph，加入碱性蛋白酶酶解，反应结束后灭酶，冷却离心收集上 清液，得到辣木蛋白酶解液；
10.步骤(3)分离：辣木蛋白酶解液经透析后，调节ph至中性，加压依次过截留分子量为10k da、 5k da、3k da、1k da的超滤膜，得到＜1k da辣木抗氧化肽组分，＜1k da辣木抗氧化肽采用离 心超滤管纯化后，冷冻干燥，然后采用tricine sds-page凝胶电泳进一步分离纯化；
11.步骤(4)鉴定：利用lc-ms对＜1k da辣木抗氧化肽进行分子量和序列鉴定。
12.进一步地，步骤(1)详细操作如下：辣木粉按料液比1：30-40溶于水中搅拌均匀，ph调至8-10， 在温度50-60℃条件下超声50-70min后，离心，取上清液添加硫酸铵，控制硫酸铵饱和度为35-45％， 搅拌均匀静置，离心弃上清取沉淀。
13.进一步地，步骤(2)的酶解条件为：辣木蛋白质量浓度为3-4％，ph值8.5-9.5，碱性蛋白酶添加 量3000-5000u/g，温度40-55℃，酶解时间4-5h。
14.进一步地，步骤3tricine sds-page凝胶采用3层不连续胶的结构，由分离胶、夹层胶和浓缩胶 构成；
15.点样、电泳：将电泳槽放入冰水浴中，外槽加入阳极缓冲液，内槽加入阴极缓冲液，25-35v预电 泳8-12min，将经过tricine专用上样缓冲处理后的样品加入点样孔后25-35v电泳1-1.5小时，80-120v 电泳至溴酚蓝到达胶底部后停止电泳，进行后续的考马斯亮蓝染色；
16.染色、脱色：采用考马斯亮蓝法染色，将胶体放进固定液中固定20-40min,倒掉固定液，用超纯水 漂洗2～3次，加入考马斯亮蓝染色液染色过夜，染色结束后加脱色液多次变换洗脱液直至电泳条带清 晰，凝胶背景洗脱干净为止。
17.进一步地，步骤(4)分析鉴定得到21个氨基酸序列，多肽分子量在722.4329da～1791.7952da 之间，肽段氨基酸含量丰富，富含亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。由于采用 超滤膜超滤会存在一定的误差，得到的多肽段分子量并不都在1kda以下，因此1kda超滤膜超滤得到 的多肽分子量在700-1800之间。
18.本发明第二方面，提供所述制备方法制备得到的辣木抗氧化肽，所述辣木氧化肽包括以下序列：
19.[0020][0021]
作为优选，所述抗氧化肽包括下述序列中的一种或几种：seq id no.7、seq id no.9、seq id no.10、 seq id no.12和seq id no.21。
[0022]
作为进一步优选，所述抗氧化肽为seq id no.7。
[0023]
本发明第三方面还提供所述辣木抗氧化肽的应用，所述辣木抗氧化肽对hepg2细胞氧化损伤具有 保护作用。
[0024]
进一步地，基于所述辣木氧化肽的抗氧化作用，所述辣木抗氧化肽能够用于制备食品、化妆品或抗 氧化药品。
[0025]
本发明的特点如下：1.辣木叶蛋白提取工艺及物理特性的研究。采用碱溶硫酸铵沉淀法提取蛋白， 在温度、ph、料液比、提取时间等因素的基础上，最佳提取条件为：温度55℃，ph值9，液料比1:40， 提取时间60min，此条件下蛋白的提取率最高，可达68.34％，且有较好的乳化性、乳化稳定性、持水 性及吸油性。所得的辣木叶蛋白在ph值4.0左右有最佳的沉降效果，在ph值为10.0时，乳化力及乳 化稳定性最高，分别为19.15m2/g、144.87％；温度在50℃时，持水性和吸油性分别为1.23g/g、1.45g/g。
[0026]
2.辣木叶抗氧化肽的制备工艺研究。以dpph自由基清除率和多肽含量为考察指标，选用胰蛋白酶、 碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在最适宜条件下对辣叶蛋白酶解，筛选出碱性蛋白酶为最适水解 酶。采用box-behnken design设计实验确定最佳酶解条件为酶解时间5h，加酶量3000u/g，酶解温度 50℃，制备得多肽含量可达23.3mg/g，酶解产物的dpph自由基清除率为73.64％。
[0027]
3.辣木叶抗氧化肽的分离纯化及结构鉴定。以抗氧活性为评价指标，采用超滤对多肽按分子量大小 分段，其不同分子量的氧化能力顺序为1kda＞3k da＞5k da＞10k da，即分子量越小抗氧化效果 越好。通过tricine-sds-page对小分子肽分离纯化，对活性肽段进行lc-ms/ms鉴定分析，得到21 个氨基酸序列，多肽分子量在722.4329da～1791.7952da之间，肽段氨基酸含量丰富，富含亮氨酸、 异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸等
具有抗氧化活性的氨基酸，其中肽段lalpvyn、 ghvalvfvn、fheeddaklf、ldegkwqhvk、lhiaalvfq的肽链的中c端或n端都存在疏水 性氨基酸且均含有芳香环、咪唑基团、含硫基团，对肽段的抗氧化活性有增强效果。
[0028]
4.辣木叶抗氧化肽对hepg2细胞氧化损伤保护效应。培养hepg-2细胞，建立氧化损伤模型，探 究辣木叶抗氧化肽的细胞毒性及细胞氧化损伤保护效应。研究明确了诱导hepg2细胞氧化损伤的最佳 条件为：在500μm h2o2条件下作用4h，模型存活率为64.03％。用不同浓度辣木叶抗氧化肽(50、100、 200μg/ml)处理细胞24h后，检测细胞存活率、细胞内gsh、cat、mda、sod含量、流式技术检 测细胞凋亡率。用药物处理后的组分细胞存活率提高至80.12～85.11％，损伤组细胞内gsh含量33.06 u/mg pro、cat含量7.39u/mg pro、mda含量11.16u/mg pro、ros含量为103.4％，与损失组相比， 药物组(50、100、200μg/ml能显著提高细胞内gsh(42.72、50.93、58.72u/mg pro)和cat(13.15、 17.15、17.50u/mg pro)活性。药物组也能够有效的降低细胞内的mda含量(3.49、5.54、6.97nmol/mgpro)，也能减少由h2o2引起的细胞内ros(71.45％、62.91％、57.91％)水平的升高。与正常相比较， h2o2会使细胞形态改变，损伤组细胞凋亡率为17.1％，经过辣木叶抗氧化肽处理后细胞凋亡率降低降 到12.93％、4.76％、4.23％。
[0029]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明以辣木叶为原料处理得到抗氧化肽，所得的 辣木抗氧化肽多为小于1000da的小分肽，活性强，抗氧化作用好，对dpph自由基、超氧自由基和羟 基自由基均具有清除效果，同时，对hepg2细胞氧化损伤有明显的保护作用，可广泛用于生产营养食 品、功能食品、化妆品和抗氧化药品等。
附图说明
[0030]
图1料液比对辣木蛋白提取率的影响；
[0031]
图2温度对辣木蛋白提取率的影响；
[0032]
图3超声时间对辣木蛋白提取率的影响；
[0033]
图4 ph对辣木蛋白提取率的影响；
[0034]
图5硫酸铵饱和度对辣木蛋白提取率的影响；
[0035]
图6不同蛋白酶水解液多肽含量和dpph自由基清除率；
[0036]
图7酶解时间对多肽含量和dpph自由基清除率的影响；
[0037]
图8酶解温度对多肽含量和dpph自由基清除率的影响；
[0038]
图9酶添加量对多肽含量和dpph自由基清除率的影响；
[0039]
图10底物浓度对多肽含量和dpph自由基清除率的影响；
[0040]
图11辣木蛋白肽的dpph自由基清除活性；
[0041]
图12辣木抗氧化肽的羟自由基清除活性；
[0042]
图13辣木抗氧化肽的超氧阴离子自由基清除活性；
[0043]
图14辣木抗氧化肽的abts自由基清除活性；
[0044]
图15各肽段lc-ms/ms质谱图；
[0045]
图16各肽段的抗氧化能力测定，粗肽为1kda超滤肽；
[0046]
图17 lalpvyn预处理对h2o2介导的氧化损伤hepg2细胞存活率的影响。(a)用不同浓度的lal 处理的hepg2细胞的存活率，(b)用不同浓度的h2o2处理的hepg2细胞的存活率，
(c)同时用lalpvyn、 vc和h2o2处理的hepg2细胞存活率。数据表示为三个独立实验的平均值
±
sem(n＝3)。lalpvyn 预处理对h2o2介导的氧化损伤hepg2细胞存活率的影响。(a)用不同浓度的lal处理的hepg2细胞 的存活率，(b)用不同浓度的h2o2处理的hepg2细胞的存活率，(c)同时用lalpvyn、vc和h2o2 处理的hepg2细胞存活率。数据表示为三个独立实验的平均值
±
sem(n＝3)；
[0047]
图18 lalpvyn预处理对h2o2介导的氧化性损伤hepg2细胞的sod、cat、gsh-p和mda的 影响。(a)lalpvyn对cat的影响，(b)lalpvyn对gsh-px的影响，(c)lalpvyn对sod的影响， (d)lalpvyn对mda的影响。数据以三个独立实验的平均值
±
sem表示(n＝3)；
[0048]
图19 lalpvyn预处理对h2o2介导的氧化损伤hepg2细胞ros的影响。(a-f)图片由激光扫描 共聚焦显微镜拍摄(g)，平均荧光强度由imagej分析。数据表示为三个独立实验的平均值
±
sem(n＝3)；
[0049]
图20 lalpvyn预处理对h2o2介导的氧化性损伤hepg2细胞凋亡的影响。(a-f)通过流式细胞 仪分析细胞周期(g)通过flowjo软件分析细胞凋亡率。数据表示为三个独立实验的平均值
±
sem(n＝3)。
具体实施方式
[0050]
实施例1
[0051]
一种辣木抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
[0052]
步骤(1)辣木蛋白提取：辣木叶粉溶于水，调节ph值，超声波辅助提取，离心收集上清液，采 用硫酸铵沉淀，离心水洗沉淀，采用透析袋透析，得到辣木蛋白，冷冻干燥；
[0053]
步骤(2)酶解：辣木叶蛋白溶解调节ph，加入碱性蛋白酶酶解，反应结束后灭酶，冷却离心收集 上清液，得到辣木蛋白酶解液；
[0054]
步骤(3)分离：辣木蛋白酶解液经透析后，调节ph至中性，加压依次过截留分子量为10k da、 5k da、3k da、1k da的超滤膜，得到＜1k da辣木抗氧化肽组分，＜1k da辣木抗氧化肽采用离 心超滤管纯化后，离心超滤3000-4000rpm，5-8min，冷冻干燥，然后采用tricine sds-page凝胶电泳 进一步分离纯化；
[0055]
步骤(4)鉴定：利用lc-ms对＜1kda辣木抗氧化肽进行分子量和序列鉴定。
[0056]
辣木蛋白提取实验条件探索
[0057]
以辣木蛋白提取率为考察指标，研究料液比(1:20、1:25、1:30、1:35、1:40)，温度(35、45、55、 65、75℃)，超声时间(20、30、40、50、60min)，ph(7、8、9、10、11)，硫酸铵饱和度(20％、 30％、40％、50％、60％)对辣木蛋白提取率的影响。
[0058]
蛋白提取率：采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，在波长595nm处，以牛血清蛋白作标准蛋白， 绘制标准曲线，标准曲线回归方程为y＝1.4458x+0.0004，r2＝0.9997(式中：x为牛血清蛋白质浓度 (mg/ml)，y为吸光值)。以溶液中蛋白提取率确定最佳工艺参数条件，制标准曲线。
[0059][0060]
公式中：c为蛋白质质量浓度，mg/ml；v提取液体积，ml；n提取液稀释倍数；m辣木叶粉质 量g。
[0061]
(1)料液比对辣木蛋白提取率的影响
[0062]
称取100g辣木粉于烧杯中，按料液比1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40搅拌均匀， ph调至9，在温度55℃条件下超声60min后，离心20min，取上清液添加40％的硫酸铵，搅拌均匀 静置2h，在离心20min，弃上清取沉淀测定溶液蛋白质含量，确定水溶性蛋白的提取率，结果如图1 所示。
[0063]
如图1所示，随着料液比的增加，蛋白提取率逐渐呈增长趋势，料液比在1：40时蛋白提取率达到 最高。原因当料液比较小时底物浓度过高，会增加溶液的粘稠度，辣木粉无法充分溶于水，降低蛋白分 子在水中的运动速度，溶解能力降低，导致大量辣木蛋白较难溶入水中；料液比超过1：35后蛋白提取 率无明显提高，且料液比高会增加水的用量，在保证蛋白提取率的前提下，考虑节约成本和后续浓缩成 本等条件，综合考虑确定最佳的提取料液比为1：35。
[0064]
(2)温度对辣木蛋白提取率的影响
[0065]
准确称取辣木粉，按料液比1：35加入超纯水搅拌均匀，ph调至9，在温度35、45、55、65、75℃ 条件下超声60min后，其他参数、条件不变，体系内加水加硫酸铵至指定体积控制硫酸铵的饱和度， 结果如图2所示。
[0066]
如图2所示温度在35～55℃之间，辣木蛋白提取率明显提高，在55℃时蛋白提取率达最高为57.26 mg/g，在温度超过55℃蛋白提取率迅速减少，原因可能是温度过高会导致蛋白质空间结构遭到破坏、 蛋白质变性，产生沉淀导致蛋白提取率下降。在35～55℃蛋白提取率增加较快，因为在低温范围内， 随着温度的升高，蛋白质的空间构象发生改变，有利于蛋白质分子、水分子的运动，且在一定范围内升 高温度有利于蛋白质本身溶解度的增强，从而提高蛋白的提取率。
[0067]
(3)超声时间对辣木蛋白提取率的影响
[0068]
按料液比1:35混合均匀，ph调至9，在温度55℃条件下超声20、30、40、50、60min，其他条 件不变，测定水溶性蛋白的提取率，结果如图3所示。
[0069]
如图3所示，超声时间对辣木蛋白提取率的影响较为显著，蛋白提取率随超声时间的增加而升高， 在70min达到提取率最高。超声时间较短，超声波的空化作用和机械剪切力作用得不到有效发挥，随 着超声时间的增加，超声波的空化效应和机械效应增强，促使植物细胞组织结构破裂，增加了蛋白质的 释放。但随着超声时间的继续增加并没有有效的促进蛋白的释放，反而会造成能源浪费、机械损耗，增 加时间成本，时间过长也会使蛋白质发生一定的物理水解，使提取率降低。故在综合考虑之下，辣木蛋 白的超声时间确定为60min。
[0070]
(4)ph对辣木蛋白提取率的影响
[0071]
准确称取辣木粉，按料液比1：35搅拌均匀，温度55℃，超声60min后，ph值7、8、9、10、 11，其他参数、条件不变，确定水溶性蛋白的提取率，结果如图4所示。
[0072]
结果如4所示，随着ph值的增加，辣木蛋白提取率增加，当ph值在6～9范围内，辣木蛋白提取 率显著增加，ph值超过9时，蛋白提取率趋于平缓。原因可能在碱性环境下会使辣木叶中某些结构变 疏松，氢键被破坏，解离某些极性基团，有利于辣木蛋白的溶解。也可能是辣木叶蛋白的等电点在4.0-4.5 之间，随着ph值的上升，蛋白质胶体离等电点越远，蛋白质的稳定性越好，浸提液中蛋白质含量也越 高。但蛋白质在强碱条件下会发生理化性质的
改变，造成蛋白质沉淀。故辣木蛋白提取ph值确定为9。 (5)硫酸铵饱和度对辣木蛋白提取率的影响
[0073]
准确称取辣木粉，按料液比1:35搅拌均匀，温度55℃，超声60min后，ph值9，其他参数、条 件不变，确定水溶性蛋白的提取率，结果如图5所示。
[0074]
如图5所示，硫酸铵饱和度对辣木蛋白提取率有显著影响，蛋白提取率随硫酸饱和度的增大而增加， 在硫酸铵饱和度为20％～40％范围内蛋白提取率增加显著，原因是由于蛋白质分子吸附低浓度的酸根离 子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用加强，因而在提取液的溶解度 增高，硫酸铵溶液饱和度过大，溶液达到过饱和，蛋白质结构变性，并且会使其他杂质如糖类沉淀出来， 影响实验结果。蛋白质的分子量越大、电荷越多沉淀时需要硫酸铵的饱和度越低，一般情况下饱和度 50％的硫酸铵溶液可将大部分蛋白沉淀出来。出于对后续实验结果考虑及成本问题，硫酸铵饱和度确定 为40％。
[0075]
辣木蛋白提取工艺正交实验设计
[0076]
在单因素实验的基础上，利用正交实验设计，选取温度、料液比、ph、三个因素为变量进行三因 素三水平的实验设计，优化辣木蛋白提取工艺参数。响应面分析因素及水平见表1。
[0077]
表1正交试验因素与水平设计因素
[0078][0079]
正交试验结果与分析
[0080]
在单因素实验的基础上，考察温度、料液比、ph值。3个因素对辣木蛋白提取率的影响，设计试 验进行正交实验，确定辣木蛋白最佳提取工艺。
[0081]
正交实验结果显示影响辣木蛋白提取率的主次顺序为ph值＞料液比＞温度。辣木蛋白的最佳提取 工艺组合为a3b3c2，即最佳工艺参数为温度55℃，料液比1:35，ph值9，硫酸铵饱和度40％。 辣木叶抗氧化肽的制备及工艺优化
[0082]
多肽含量的测定：以肽的浓度为横坐标x(mg/ml)，od值为纵坐标y，制作标准曲线。标准曲线 回归方程为y＝17.925x-0.0069，r2＝0.9995(式中：x为多肽浓度(mg/ml)，y为吸光值)。
[0083]
(1)蛋白酶的筛选
[0084]
选用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶四种蛋白酶作为预筛选酶，在底物浓度为 3％、酶解时间3h、在各自最适酶解条件下进行酶解，以多肽含量和酶解产物的dpph自由基清除率为 考察指标。
[0085]
以dpph自由基清除率和多肽含量为指标，辣木蛋白经四种不同蛋白酶的酶解效果如图6所示， 碱性蛋白酶酶解产物具有最高的多肽含量8.19mg/g和dpph自由基清除率72.64％，明显优于其他蛋白 酶。碱性蛋白酶水解能力强，有较多的酶切位点，产生更多的
小分子肽。
[0086]
(2)单因素实验
[0087]
以辣木蛋白酶解后的多肽含量和dpph自由基清除率为指标。考察酶解时间(1、2、3、4、5h)， 酶解温度(30、40、50、60、70℃)，酶添加量(1000、2000、3000、4000、5000u/g)，底物浓度 (1％、2％、3％、4％、5％)对辣木蛋白多肽含量和dpph自由基清除率的影响，确定制备最佳辣木抗 氧化肽的最佳因数水平。
[0088]
①
酶解时间对多肽含量和dpph自由基清除率的影响
[0089]
在试验条件温度60℃、底物浓度3％、ph值9，酶添加量4000u/g，研究不同酶解时间对蛋白水 解的影响。如图7所示，多肽含量和dpph自由基清除率随着酶解时间的延长，先升高后趋于平稳， 可能是底物基本反应完，也可能酶解时间过长，酶解得的抗氧化多肽会进一步水解成氨基酸，故选择4 h为最适酶解时间。
[0090]
②
酶解温度对多肽含量和dpph自由基清除率的影响
[0091]
在试验条件底物浓度3％、ph值9、酶添加量4000u/g、酶解时间4h研究不同酶解温度对蛋白水 解的影响。如图8所示，辣木多肽含量和dpph自由基清除率随温度的升高呈先上升后下降，在50℃ 多肽含量、dpph自由基清除率最高；这可能与碱性蛋白酶的最适温度有关，温度过高会对酶的空间结 构产生影响，降低酶活。
[0092]
③
酶添加量对多肽含量和dpph自由基清除率的影响
[0093]
在试验条件底物浓度3％、ph值9、酶解时间4h、酶解温度50℃，研究不同酶添加量对蛋白水 解的影响。如图9所示，随着酶添加量的增大，多肽含量先增加后趋于平缓，酶添加量5000u/g时， 多肽含量达最大0.85mg/0.1g，dpph自由基清除率先增大后下降，酶添加量在4000u/g时，dpph自 由基清除率为66.93％。因为酶与底物浓度达到一种饱和的状态，继续添加酶量也不会增加其酶解速度。
[0094]
④
底物浓度对多肽含量和dpph自由基清除率的影响
[0095]
在试验条件ph值9、酶解时间4h、酶解温度50℃、酶添加量4000u/g，研究不同底物浓度对蛋 白水解的影响。如图10所示，增加底物浓度，多肽含量先增加后减少，底物浓度为4％时，多肽含量 达最大值2.26mg/0.1g，底物浓度在3％时，dpph自由基清除率达最大值76.89％，随后有下降趋势。 底物浓度较低时，不利于酶与蛋白质分子相互作用，浓度过高，会影响蛋白水解，清除率会受到抑制。
[0096]
响应面实验设计及结果
[0097]
在单因素实验的基础上，采用box-behnken实验设计原理，以酶解温度、ph值、酶添加量3个因 素为变量，进行3因素3水平的试验设计，优化辣木抗氧化多肽的工艺参数。因素水平见表2。
[0098]
表2响应面因素水平表
[0099]
[0100][0101]
从单因数试验结果可知，酶解时间、ph值、酶添加量对辣木多肽含量、dpph清除率影响显著， 以多肽含量和dpph清除率为响应值，采用box-behnken中心组合进行实验设计(3因数3水平)优化。
[0102]
回归模型通过响应面法得到最优辣木叶酶解液dpph自由基清除率及多肽含量的工艺条件酶解时 间4.13h、ph值8.99、酶添加量4026.90u/g，多肽含量2.33mg/g、dpph自由基清除率为78.61％。按 实验可操作性将最佳条件调整为酶解时间4h、ph值为9、酶添加量为4000u/g，此条件下进行实验多 肽含量为2.33mg/0.1g，dpph自由基清除率为79.22％与理论值相近。
[0103]
辣木抗氧化肽的分离纯化
[0104]
辣木抗氧化肽的超滤法分离
[0105]
辣木蛋白酶解液经透析后，调节ph为7，在压力0.3mpa下依次过截留分子量为10kda、5kda、 3kda、1kda的超滤膜，得到不同分子量的4个组分，各个组分样品颜色按分子量从小到大逐渐加深， 最小分子量＜1kda的样品颜色最浅呈淡黄色，说明超滤处理能对辣木抗氧化肽起到较佳的脱色作用。 对获得的4个组分进行体外抗氧化活性研究
[0106]
(1)dpph自由基清除活性测定
[0107]
由于dpph自由基带有奇电子离子，因此它在乙醇溶液中是稳定的，并且在517nm处有最大吸收 峰。当dpph与质子给体聚合物反应时，dpph自由基数会下降，在517nm处的吸收峰也会减弱。如 图11所示，辣木抗氧化肽对dpph均具有一定的清除能力，随浓度的增大而增强，具有剂量依赖性， 当浓度为1mg/ml时，不同分子量的清除率分别为53.17％、45.34％、38.12％、29.81％。
[0108]
(2)羟自由基清除能力
[0109]
·
oh是氧自由基中最活跃的自由基，几乎能够轻易地损坏所有的大分子物质，如蛋白质、酶、碳水 化合物、脂质(过氧化)和核酸(突变)加快机体的衰老和某些疾病的发生。如图12所示不同分子量3kda、 5kda、10kda对
·
oh的清除率比较接近，在浓度为1mg/ml时他们的清除率分别为36.58％、33.94％、 30.76％，小分子1k da相对其他三个分子量具有较好清除活性，当浓度为1mg/ml时，清除活性为 44.28％。
[0110]
(3)超氧阴离子自由基清除能力
[0111]
邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化反应，产生的中间物与稳定浓度的超氧阴离子自由基，中间物 又与超氧阴离子自由基反应，能够得到一种带有颜色的中间产物，此物在325nm处有吸收，吸光值的 积累与中间产物的质量呈现相关性。如图13所示，辣木抗氧化肽对超氧阴离子均有一定的清除能力， 小分子1kda具有较好的清除活性，浓度1mg/ml时，清除能力最强为44.45％，分子量为10kda辣 木蛋白肽超氧阴离子清除活性较弱，浓度1mg/ml时，清除能力为24.1％。
[0112]
(4)abts自由基清除能力
[0113]
abts是一种自由基引发剂，被过硫酸钾氧化生成稳定的蓝绿色自由基(abts+)，abts自由基 易从abts中获取电子或质子，在734nm处具有强吸收，若加入的受试样品对
abts+具有清除能力则 颜色会褪去。如图14所示，gsh对abts自由基清除效果显著。不同分子量的辣木抗氧化肽对abts 自由基都有清除活性，对abts自由基清除活性呈现出随着浓度的增加而增强的趋势。分子量在1kda 的抗氧化肽在不同浓度都具有最强清除能力，在1mg/ml时abts清除活性最高为47.61％，3k da、5 kda、10k da的abts清除活性分别为45.70％、42.13％、20.81％。小分子量的抗氧化肽具有较强清 除活性。
[0114]
由于1kda和3kda的抗氧化肽具有更强的抗氧化活性，因此主要对1kda和3kda的抗氧化肽 进行分离鉴定。
[0115]
(2)辣木抗氧化肽相对分子量分布
[0116]
由表3可知超滤后的抗氧化肽主要由小分子肽构成，相对分子质量主要集中在600-1000da，超滤 1k da和3k da后的固体粉末中相对分子量1000da以下分别占比84.15％和79.61％，通过计算机搜 索数据库ncbi全库得到309和494个肽段数，表示超滤后的肽段组成复杂，需要进一步分离纯化。
[0117]
表3辣木抗氧化肽相对分子质量分布
[0118][0119]
tricine-sds-page分离纯化
[0120]
tricine sds-page的凝胶采用3层不连续胶的结构，由分离胶、夹层胶和浓缩胶构成，各层胶由 不同分子组成的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合而成。(表4)
[0121]
表4浓缩胶、分离胶及夹层胶组成
[0122][0123]
点样、电泳：将电泳槽放入4℃或冰水浴中，外槽加入阳极缓冲液，内槽加入阴极缓冲液，30v 预电泳10min，将样品(经过tricine专用上样缓冲处理)加入点样孔后30v电泳1小时，100v电泳 至溴酚蓝到达胶底部后停止电泳，进行后续的考马斯亮蓝染色。
[0124]
染色、脱色：采用考马斯亮蓝法染色。将胶体放进固定液中(乙醇:冰醋酸:水＝5:1:4)固定30min,倒 掉固定液，用超纯水漂洗2～3次，加入考马斯亮蓝染色液(1.6％磷酸，8％硫酸铵，0.02％cbb，g250、20％乙醇)，过夜染色，染色结束后加脱色液多次变换洗脱液直至电泳条带清晰，凝胶背景洗脱干净为 止。
[0125]
纯化蛋白肽进行lc-ms/ms分析
[0126]
将电泳胶条进行序列鉴定，数据采集软件：thermo xcalibur4.0(thermo,usa)；反相柱信息：c18column(75μmx 25cm，thermo，usa)；色谱仪器：easy-nlc 1200；质谱仪器：q-exactive(thermo， usa)；色谱分离时间：90min a：2％acn with 0.1％formic acid；b：80％acn with 0.1％formic acid； 流速：300nl/min，easy-nlc梯度：0-1min 5％b、1-41min 23％b、41-51min 29％b、51-57min38％b、57-58min 48％b、58-59min 100％b、59-90min stop；ms扫描范围(m/z)350-1300，采集模 式dda；top 20(选择母离子中信号最强的20个进行二级碎裂)；一级质谱分辨率70000，碎裂方式 hcd；二级分辨率17500，动态排除时间18s。
[0127]
lc-ms/ms鉴定结果
[0128]
(1)辣木抗氧化肽氨基酸组成
[0129]
表5不同分子量辣木抗氧化肽的氨基酸组成
[0130][0131][0132]
多肽的抗氧化能力与构成肽的氨基酸种类、数量及氨基酸排列密切相关。许多氨
基酸及其衍生物有 清除自由基的能力，如:lys、his、tyr、met、pro、arg、glu、cys等。表5显示辣木抗氧化肽1k da、 3k da固体粉和胶条中氨基酸含量丰富，经tricine-sds-page电泳分离纯化后的胶条中谷氨酸、赖氨 酸、精氨酸的含量比固体粉末中的含量高，这些氨基酸大部分与抗氧化活性相关，其中谷氨酰胺在保护 细胞膜的完整性、维持细胞活力及降低细胞氧化损伤方面具有重大贡献。
[0133]
(2)对目标胶条分子量和序列鉴定
[0134]
化学结构是影响多肽抗氧化活性的关键因素，抗氧化肽一般由2-20个氨基酸组成，有研究表明多 肽氨基酸组成、分子量、排列顺序都与其抗氧化活性有着较大的相关性。肽序列中含有p、g、a、v、 l的蛋白肽具有潜在的抗氧化活性。多肽中氨基酸残基的特殊支链结构被认为是自由基的直接清除者， 如含苯环的苯丙氨酸(phe)，含吲哚基的色氨酸(trp)，含咪唑环的组氨酸(his)，含酚羟基的酪 氨酸(tyr)，以及含硫的半胱氨酸(cys)和甲硫氨酸(met)等。肽序列n端或c端含有疏水性氨基 酸(v、l、i、a、f)，肽链c端第三个氨基酸处是疏水性氨基酸残基，并且具有低静电排斥、空间 位阻、氢键作用(w、y、f、m、l、i)对抗氧化活性有影响；肽链中具有酸性氨基酸残基(d、e) 能增强抗氧化活性。
[0135]
表6辣木抗氧化肽氨基酸序列鉴定
[0136][0137][0138]
普遍认为，构成蛋白的20种氨基酸均可以与自由基发生反应，但活性差异较大，对辣木多肽超滤 进行电泳分离，对小于1k da分子胶条进行分子鉴定，并评估其抗氧化能力
差异。由表6可知，辣木 抗氧化肽21个氨基酸序列，分子量在722.4329da～1791.7952da之间，由6～16个氨基酸组成；多数 肽段中50％以上的氨基酸(p、g、a、v、l)具有潜在的抗氧化活性，且肽链中含有芳香环、咪唑基 团、含硫基团能增强肽段的抗氧化活性。肽段7、9、10、12、14、19、21的肽链的中c端或n端都存 在疏水性氨基酸且都含有芳香环、咪唑基团、含硫基团对多肽的抗氧化活性具有一定的影响。
[0139]
研究表明，抗氧化肽的抗氧化能力大多与多肽的分子量、特定类型氨基酸、氨基酸的种类、序列、 构型等有密切关系。肽链中存在酸性氨基酸、具有质子供体特性的氨基酸残基、疏水性氨基酸出现在侧 链或者c、n端、含有芳香族氨基酸等是抗氧化肽一级结构存在的重要特征。多肽的分子量越小，则越 容易透过生物膜达到作用部位起效；含有疏水性氨基酸，带正电荷，可与氧结合或抑制脂质中氢的释放， 延缓脂质过氧化链式反应，起到抗氧化作用，富含脯氨酸易于氧化而发生抗氧化活性；含有芳香环、咪 唑基团、含硫基团的肽链能直接猝灭自由基；肽链c端第三个氨基酸处是疏水性氨基酸残基，并且具 有低静电排斥、空间位阻、氢键作用，对抗氧化活性有影响，肽链中具有酸性氨基酸残基能增强抗氧化 活性，经综合分析确定图15中五种多肽为抗氧化潜力最强的小分子肽。
[0140]
肽段分离：处理电泳胶条得到蛋白溶液，采用rp-hplc反相高效液相色谱进行分离，色谱柱为c18 柱，流动相为第一混合液+第二混合液，进行线性洗脱，第一混合液由99.8％的水和0.2％三氟乙酸混合 而成，所述第二混合液由99.8％乙腈和0.2％三氟乙酸混合而成；线性洗脱的条件为：洗脱时间60min， 自第二混合液占流动相的体积比为0％开始，至75％结束洗脱，流速为0.8ml/min，检测波长为280nm， 分离纯化得到5个多肽并进行鉴定，肽1为lalpvyn；肽2为fheeddaklf；肽3为ldegkwqhvk； 肽4为lhiaalvfq；肽5为ghvalvfvn。
[0141]
实施例2氨基酸序列抗氧化能力的测定
[0142]
以dpph自由基清除能力、羟自由基清除能力的测定、超氧阴离子自由基清除活性、abts自由 基清除能力测定等4个抗氧化指标为参考，研究分离得到的不同多肽的抗氧化能力。
[0143]
(1)dpph自由基清除能力的测定
[0144]
称取4mg的dpph溶于100ml的无水乙醇中，制备成0.1mmol/l dpph的乙醇溶液，在棕色瓶 中密封保存，放置在4℃的冰箱中。取样品待测溶液0.5ml和0.5ml 0.1mmol/l的乙醇溶液于2ml 的离心管中，避光反应50min，离心(10min 4000r/min)在波长517nm下测定吸光值。
[0145][0146]
式中：a
空
空白管用无水乙醇代替0.1mmol/l的dpph；a
对
0.5ml无水乙醇和0.5ml的0.1mmol/ldpph的乙醇溶液；a
样
0.5ml的样品待测液和0.5ml的0.1mmol/l dpph的乙醇溶液。
[0147]
(2)羟自由基清除能力的测定
[0148]
参照现有方法，取8.8mmol/l h2o2，0.5ml 9mmol/l fe
2+
，0.5ml 9mmol/l水杨酸-乙醇溶液0.5 ml)中加入100μl不同浓度的辣木蛋白酶解产物，用蒸馏水做空白组a0，在510nm处测量各浓度下 的吸光值a1，羟自由基清除能力公式如下：
[0149][0150]
式中：a0样品组光吸收值；a1:空白组光吸收值
[0151]
(3)超氧阴离子自由基清除活性
[0152]
参照现有方法，取2.25ml ph 8.2的tris-hcl缓冲液(0.1mol/l)，加入l ml蒸馏水和1ml不同浓 度样品溶液，再加入0.25ml 10mmol/l的邻苯三酚。混合均匀后25℃下水浴，在第3min时加入1 滴浓hcl来中止反应，并在325nm波长下测吸光值。取不同浓度的谷胱甘肽作为对照。清除率计算公 式如下：
[0153][0154]
式中：a0为用蒸馏水代替样品溶液的空白样吸光值；a1为样品溶液吸光值；a2为不加邻苯三酚溶 液吸光值。
[0155]
(4)abts自由基清除能力测定
[0156]
abts自由基清除活性参照现有方法并进行适当修改，2.45mmol/l过硫酸钾容易与7mmol/l abts 母液按1:1比例混合，避光反应12-16h，用5mm ph 7.4的pbs稀释，在734nm处测量使其吸光值为 0.7～0.8，将不同浓度待测样品与已稀释abts自由基工作液按1:1比例混合，室温下避光反应10min， 用蒸馏水做空白，不同浓度的谷胱甘肽做阳性对照，计算公式如下：
[0157][0158]
式中，as为样品组吸光值；a0为空白组吸光值。
[0159]
由于分离纯化出的五种多肽的含量较小，为了验证后期的抗氧化活性和细胞损伤修复的作用，故采 用合成法大量得到五种多肽进行进一步抗氧化活性的研究。
[0160]
由图16可知，五种氨基酸序列合成后测定其抗氧化活性发现，合成后的lalpvyn、fheeddaklf、 ldegkwqhvk、lhiaalvfq、ghvalvfvn氨基酸序列的抗氧化活性较强，其中lalpvyn的抗 氧化活性高于其他氨基酸序列，且接近vc的抗氧化能力。
[0161]
实施例3 lalpvyn对hepg2细胞氧化损伤的保护作用
[0162]
mtt细胞活力测定方法
[0163]
hepg2细胞均在37℃、5％co2加湿的环境中培养。所有培养基中均添加10％胎牛血清和1％青霉 素-链霉素混合物。将处于对数生长期的hepg2细胞接种于96孔板，调整为每孔1
×
104个细胞的浓度。 培养24h后，对照组加入200μl培养基。实验组用不同浓度的lalpvyn(50、100、250、500和1000 和2000μg/ml)处理细胞。空白组在未加入hepg2细胞的情况下加入lalpvyn。培养24h后向每孔 加入100μl 0.25mg/ml mtt。再培养4小时后，用dmso替换培养基，用微板阅读器在波长490nm 处测量od值。按下列公式计算存活率:hepg2细胞存活率(％)＝(odexperimental组-odblank 组)/(odcontrol组-odblank组)
×
100％
[0164]
lalpvyn对h2o2介导的氧化损伤hepg2细胞活率的影响实验
[0165]
hepg2细胞培养24h后，吸附200μl悬浮液，接种于96孔板，密度为1
×
104/孔，分组为对照组、 保护组和氧化损伤组。保护组的制备采用以下步骤：分别加入200μlvc(60μg/ml)、lalpvyn(50、 100、200μg/ml)dmem溶液，孵育24h后，每孔加入200μl h2o2(0.5mmol/l)
孵育4h，氧化损伤组 按以下步骤制备：加入200μldmem培养液，孵育24h后，每孔加入200μl h2o2(0.5mmol/l)孵育4h。 对照组加入200μl培养基培养28h；空白组在未加入hepg2细胞的情况下加入lalpvyn，培养28h。 mtt法测细胞活率。
[0166]
hepg2细胞内抗氧化能力分析
[0167]
将hepg2细胞以3
×
105个/皿接种4ml于6个60mm细胞培养皿中。进行不同处理后(分组同2.5.2)， 依照试剂盒说明书中方法测定细胞裂解产物中总超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)活性和丙二 醛(mda)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的含量。
[0168]
ros采用活性氧检测试剂盒测定，将hepg2细胞2
×
105个/孔接种于激光共聚焦皿中，按照上述实 验分组法处理细胞。用激光共聚焦显微镜拍摄图片，imagej进行荧光强度分析。
[0169]
细胞凋亡检测
[0170]
以3
×
105个/孔hepg2细胞接种6孔板中，按照annexin v-fitc试剂盒说明书采用流式细胞仪 (ex＝488nm，fl1 em＝525
±
20nm，fl2 em＝585
±
21nm)和flowjo软件，检测hepg2细胞凋亡率。
[0171]
统计分析
[0172]
所有的测试都是在三个独立的试验中进行的，数据的平均值
±
标准差被报告。使用spss19.0(ibmcorp.，armonk，ny，usa)对不同处理组之间的差异进行单因素方差分析(anova)对结果进行显著性 分析，差异有显著性意义(p《0.05)。
[0173]
h2o2是一种众所周知的肝毒性化学物质，半衰期长，可直接转化为羟自由基和氧自由基，是体内 氧化应激损伤的重要诱因。为了表明lalpvyn的抗氧化活性，采用h2o2建立氧化损伤模型，评价其 抗氧化活性。
[0174]
lalpvyn的抗氧化作用如图17，首先研究lalpvyn对hepg2细胞存活率的影响(a)，结果 表明辣木蛋白肽对hepg2细胞无促进生长作用，随着浓度的增加，对hepg2细胞存活率出现下降趋势。 与对照组相比较，在50-500μg/ml范围内细胞存活率为(97.95
±
1.18-93.03
±
0.56)％，对细胞无毒性作用 (＞90％)。当lalpvyn浓度达1000μg/ml时，与空白组相比较显著减少，对细胞产生毒性作用， 综合考虑之下选择50、100、200μg/ml进行实验。其次建立氧化损伤模型(b)，结果表明用不同浓 度的h2o2诱导细胞4h均对细胞造成损伤效果并且随着浓度的增大，细胞存活率降低。0.5mmol/l h2o2诱导细胞4h，细胞存活率为(54.09
±
1.58)％，接近半抑制细胞浓度，确定建立细胞氧化损伤模型浓度。 最后研究lalpvyn的抗氧化效果(c)，结果表明lalpvyn预处理后细胞存活率在(80.12
±
1.47～85.11
±
3.24)％之间，接近vc预处理的细胞活率，说明辣木抗氧化肽预处理能够有效的降低细胞氧化损 伤作用。
[0175]
lalpvyn预处理对hepg2细胞sod、cat、gsh-px、mda的影响
[0176]
细胞内抗氧化剂的抗氧化能力可分为直接和间接两个方面。抗氧化剂的直接抗氧化性是通过提供氢 原子或电子来去除细胞内的ros来实现的。抗氧化剂的间接抗氧化性是通过介导抗氧化酶和抗氧化剂 基因的表达来抵抗细胞氧化损伤的。以往的研究证实，细胞内的抗氧化酶系统是抵御氧化应激损伤的重 要防御系统，为阐明lalpvyn对h2o2介导的hepg2细胞氧化应激损伤的保护作用机制，研究了 lalpvyn对hepg2细胞cat、gsh-px、mda、sod含量的影响,具体机制详见图18。
[0177]
抗氧化酶活性水平的变化可以被认为是细胞对氧化应激反应的一个重要生物标志物。超氧化物歧化 酶(sod)催化高活性超氧阴离子从氧化应激转化为过氧化氢(h2o2)，进而被过氧化氢(cat)分解为水和 氧气。从图18a可得，正常细胞内的cat酶活较高((27.15
±
2.29)u/mg pro)，损伤组内酶活最低 (7.38
±
0.63u/mg pro)，经lalpvyn预保护cat酶活比起损伤组均有不同程度的提高，分别为 (13.15
±
2.29)、(17.15
±
2.13)、(17.50
±
1.75)u/mgpro。从图18b可得，正常细胞内sod酶活为(11.16
±
0.32) u/mg pro，损伤组内酶活最低((6.83
±
0.35)u/mg pro)，经lalpvyn预处理后sod酶活为(8.33
±
0.053) u/mg pro、(8.74
±
0.17)u/mg pro、(9.04
±
0.19)u/mg pro显著提高。
[0178]
过氧化物酶(gsh-px)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，它能催化gsh变为gssg， 使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进h2o2的分解，保护细胞膜的结构及功能不受过 氧化物的干扰及损害。与正常组(67.72
±
1.36)umg/pro)相比，损伤组内gsh-px含量显著降低酶活 为(33.06
±
1.46)umg/pro，经lalpvyn预保护的药物组与损伤组相比gsh-px酶活均有不同程度的 增加，通过lalpvyn处理后的gsh-px含量分别为(42.72
±
1.36、50.93
±
1.25、58.72
±
1.36umg/pro)。 药物组与损伤组相比，gsh-px含量明显上升。说明lalpvyn可以提高因h2o2造成的氧化损伤的 hepg2细胞内gsh-px的含量。
[0179]
丙二醛是一种三碳化合物，是脂质过氧化的指示物，是过氧化多不饱和脂肪酸分解的一个组成部分。 细胞在代谢过程中产生的ros可与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧 化形成mda。mda是细胞氧化损伤的重要指标，其含量越高，表明细胞氧化损伤越严重。正常组细 胞的mda水平较低为(2.49
±
0.25)nmol/mg pro，损伤组相比正常对照组mda含量明显升高达 (11.16
±
0.088)nmol/mg pro。与模型组相比较，药物组(50、100、200μg/ml)mda含量显著降低， mda含量分别为(3.49
±
0.28)、(5.54
±
0.11)、(6.97
±
0.52)nmol/mg pro(p＜0.001)，且与药物呈 明显的剂量效应关系。说明辣木抗氧化肽能有效的抑制脂质过氧化反应，减少丙二醛的产生，分析其原 因可能是lalpvyn中含有疏水性氨基酸，对疏水的多不饱和脂肪酸有很高的结合力，对细胞氧化损 伤具有一定的保护效应。
[0180]
综上所述lalpvyn不仅可以清除细胞内自由基，还可以增强内源性抗氧化防御系统，包括抗氧 化酶防御系统和谷胱甘肽系统，从而减少h2o2诱导的hepg2细胞产生的mda和自由基，达到保护细 胞的作用。与chao等人研究西瓜籽抗氧化肽对h2o2诱导的氧化应激的细胞保护作用中，抗氧化肽的 处理显著减弱了h2o2诱导的抗氧化酶活的降低结果一致。抗氧化效果优于ying等人研究的鸭胚胎肽， 并且lalpvyn较小的剂量就能显著缓解抗氧化酶活降低的效果。
[0181]
lalpvyn预处理对hepg2细胞ros的影响
[0182]
研究表明，过量的ros会使蛋白质和脂质氧化，进而导致细胞核dna和线粒体完整性被破坏， 并最终导致细胞死亡。dcfh-da是一种针对细胞内活性氧类物质的特异性荧光探针，其可穿透细胞膜 并被膜中酯酶降解成dcfh，而dcfh进一步与胞内ros特异性结合生成可以发射荧光信号的dcf。 因此，可通过激光共聚焦拍摄照片，imagej软件测定荧光强度的变化，反映细胞中ros含量的变化。
[0183]
lalpvyn对h2o2介导hepg2细胞ros含量的影响如图19所示。损伤组的ros平均荧光强度 (36.57
±
0.44)与正常对照组(11.26
±
0.027)相比有显著差异，说明h2o2能引起hepg2
细胞内的ros 水平的升高；药物组的ros平均荧光强度相比于h2o2损伤组明显降低(32.93
±
1.1、25.92
±
0.51、 24.99
±
0.57)，其中多肽浓度为200μg/ml的组分ros含量接近阳性对照vc组(23.14
±
0.69)，多肽 浓度为50μg/ml、100μg/ml的组分与损伤组相比也有显著差异。lalpvyn的这种细胞保护作用可能 是由于其具有清除细胞内ros的抗氧化能力。综上说明辣木叶抗氧化肽lalpvyn通过清除细胞内 ros起到抗氧化的效果。
[0184]
lalpvyn预处理对hepg2细胞凋亡的影响
[0185]
细胞凋亡是细胞正常周转、免疫系统正常发育和功能、胚胎发育、化学诱导细胞死亡和激素依赖性 萎缩等过程的重要组成部分。细胞凋亡异常与许多人类疾病有关，如缺血性损伤、自身免疫性疾病和癌 症。细胞凋亡分析总是被用来评估生物活性成分作为食品补充剂或化疗药物的潜在用途。
[0186]
用不同浓度的lalpvyn(50、100、200μg/ml)处理hepg2细胞，采用流式细胞术检测lalpvyn 对hepg2细胞凋亡的影响。正常组hepg2细胞凋亡率较低为(1.43
±
0.19)％，损伤组细胞凋亡率显著 增加，达(15.93
±
0.93)％；用50-200ug/ml lalpvyn处理细胞，凋亡率明显下降，200ug/ml lalpvyn 的凋亡率最低为(4.28
±
0.22)％。且200ug/ml lalpvyn处理组细胞凋亡率比0.19mg/ml gsgh处 理组细胞凋亡率低，说明lalpvyn缓解氧化应激引起的细胞凋亡比gsgh效果好。综上结果表明 lalpvyn对h2o2介导的氧化应激损伤有保护作用，其中200ug/ml的lalpvyn保护作用最明显。
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综上所述，本发明使用碱性蛋白酶有效地水解辣木叶蛋白，得到具有抗氧化活性的成分，并通过膜 超滤将水解液分离为三个组分。低分子量组分(《1kda)具有较强的自由基清除能力。经超滤管进一步分 离，筛选合成得到5个组分(lalpvyn、fheeddaklf、ldegkwqhvk、lhiaalvfq、ghvalvfvn) 抗氧化活性较强多肽，其中lalpvyn组分分子量为788.44da对各自由基清除率均优于其它多肽。同 时也证明lalpvyn对h2o2诱导的hepg2细胞氧化损伤有较好的保护作用。尤其在提高cat、gsh、 sod活性、降低mda含量、减少ros含量、抑制细胞凋亡方面，综合分析lalpvyn对hepg2细 胞的保护作用较强，与vc相比具有一定的潜力，mlph有可能成为食品中的天然抗氧化剂，同时小 于1kd辣木多肽也可以作为抗氧化食品的原料。
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以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术 领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。