一株具有溶藻作用的蜡样芽孢杆菌B1-XL001及其应用

一株具有溶藻作用的蜡样芽孢杆菌b1-xl001及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物控藻技术领域，具体涉及一株具有溶藻作用的蜡样芽孢杆菌b1-xl001及其应用。


背景技术：

2.有害藻华(harmful algal blooms,habs)是水体中浮游植物(蓝藻、硅藻和绿藻等藻类))的生长繁殖和聚集现象，属于世界性问题，对水系统有许多负面影响，会威胁和危害海洋生态环境。近年来，富营养化湖泊和河流中的habs主要由蓝藻组成,而蓝藻中的铜绿微囊藻在爆发频率和数量上占据了绝对优势，铜绿微囊藻会分泌藻毒素，从而严重影响水资源，其爆发性生长繁殖还会恶化水质。因此，有害藻华的控制至关重要。
3.利用溶藻细菌控制有害藻华是一种很有前景且环境友好的方法。目前已知的大多数溶藻细菌属于嗜细胞菌(cytophaga)、黄杆菌(flavobacterium)、拟杆菌【bacteroidetes(cfb)】、γ-变形菌属(γ-proteobacteria)、交替单胞菌(alteromonas)、芽孢杆菌(bacillus)、微球菌(genera micrococcus)、动性杆菌(planomicrobium)、假单胞菌(pseudomonad)以及弧菌(vibrio)等。但目前对溶藻细菌的研究多处于实验室阶段，因为现有的溶藻细菌或多或少都存在一些应用上的问题。比如某些溶藻细菌不具有长期溶藻的稳定性，可能会导致藻华现象复发；某些溶藻细菌在投量比较大的情况下才具有强溶藻效果；某些溶藻细菌分泌的溶藻活性物质不稳定。因此，挖掘稳定性好的溶藻细菌至关重要。
4.芽孢杆菌属具有生长快、易运输和分布广泛等优点,在生物防治领域、水质净化和促进饲料营养素降解等方面有着广泛的应用，而对于芽孢杆菌的溶藻研究，特别是抑制蓝藻生长的研究，目前还是比较少的。比如，有研究发现枯草芽孢杆菌可以在培养液中产生表面活性剂而抑制蓝藻的生长；梭状芽孢杆菌则通过分泌代谢产物而对栅藻、铜绿微囊藻和小球藻起溶藻作用。然而，目前尚未有蜡样芽孢杆菌菌株用于控制蓝藻藻华的研究。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一株蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株，该蜡样芽孢杆菌具有极高的溶藻效果，有广范围的温度稳定性(-20℃-100℃)，能够耐强酸，并且菌液反复冻融不会影响溶藻效果。
6.为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
7.本发明提供一株蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株，所述b1-xl001菌株于2017年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no:60245，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
8.本发明从中山大学东校园的谷河中筛选得到一株溶藻效果的菌种，经16srdna(seq id no:1)鉴定为新的蜡样芽孢杆菌属(bacillus cereus)，并将其名称为bacillus cereus b1-xl001。
9.本发明还提供了所述的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株在控制有
害藻华中的应用。
10.本发明还提供了所述的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株的分泌物在控制有害藻华中的应用。
11.优选地，所述有害藻华为由蓝藻引起的藻华。
12.进一步地，所述有害藻华为由铜绿微囊藻引起的藻华。
13.目前对蜡样芽孢杆菌的溶藻研究较少，本发明提供一株新型的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株，该细菌生长迅速，于37℃、150r/min条件下用lb液体培养基培养5小时就能达到至od
60
0＝0.8-1.0，该菌对铜绿微囊藻具有很强的趋化性，能够附着到藻细胞外部，且其分泌物能破坏藻细胞的细胞壁、细胞膜和类囊体，抑制藻类光合作用，造成藻类不可逆的损伤，使其死亡。同时，通过对本发明的蜡样芽孢杆菌菌株进行生物学特性研究，发现该菌株的溶藻物质可能是一种新型溶藻物质，且物质种类多样，热稳定性和反复冻融稳定性强，将其研发成新杀藻剂时无需担心温度和反复冻融的影响，具有很好的应用潜力。
14.优选地，所述分泌物包括b1-xl001菌株的发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。
15.本发明还提供了一种溶藻菌剂，所述菌剂包括所述的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株。
16.本发明还提供了一种溶藻菌剂，所述菌剂包括所述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株的分泌物。
17.当然，为增加产品的适用范围，上述两种菌剂还可以包括其他在溶藻领域能被接受的辅剂。
18.本发明还提供了一种控制有害藻华的方法，即往待处理的富营养化水体中投入所述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株的菌液，所述菌液的投入量不少于水体体积的2％。
19.优选地，所述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株的菌液的制备方法为：将蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株接种在lb液体培养基中，并于37℃、150r/min条件下培养至od
600
＝0.8-1.0。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21.本发明公开了一株蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)b1-xl001菌株，该菌株生长速度快，对藻类具有很强的趋化性，能够附着到藻细胞外部，且其分泌物能够破坏藻细胞的细胞壁、细胞膜和类囊体等结构，抑制藻类光合作用，造成藻类不可逆的损伤，使其死亡，且稳定性好，具有广范围的温度稳定性(-20℃-100℃)，能够耐强酸，并且菌液反复冻融不会影响溶藻效果，不会有藻华复发的风险，可制备成溶藻菌剂用于控制有害藻华，具有很好的应用潜力。
附图说明
22.图1为菌株b1-xl001的扫描电镜图；
23.图2为菌株b1-xl001的菌落形态图；
24.图3为菌株b1-xl001的生长曲线；
25.图4为不同b1-xl001菌液对铜绿微囊藻的抑制率；
26.图5为菌株b1-xl001对铜绿微囊藻的溶藻显微图；
27.图6为菌株b1-xl001对铜绿微囊藻的不同时期溶藻效果图；
28.图7为菌株b1-xl001的趋化能力检测结果；
29.图8为不同温度下b1-xl001菌液对铜绿微囊藻的抑制率；
30.图9为不同ph下b1-xl001菌液对铜绿微囊藻的抑制率；
31.图10为不同冻融次数下b1-xl001菌液对铜绿微囊藻的抑制率；
32.图11为富营养化池塘；
33.图12为菌株b1-xl001对实际水体中叶绿素a的去除效果；
34.图13为投加菌株b1-xl00112天后的水样对比图。
具体实施方式
35.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
36.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
37.实施例1蜡样芽孢杆菌菌株的分离、鉴定
38.取中山大学东校园谷河中的水样进行lb培养基(蛋白胨10g、牛肉浸膏5g、葡萄糖1g、氯化钠1g，去离子水1l)平板涂布，经过35℃恒温培养48小时后，培养基上长出多种微生物，分别对不同形态的微生物进行划线分离提纯。将提纯后的菌剂接种到灭菌的lb液体培养基中，在120rpm、35℃的恒温摇床中培养12h形成悬菌液，然后取4ml悬菌液加入到200ml接种藻液中，在25℃、2500lux，光暗比为12h：12h的条件下培养12天，并在第0、4、8、12天采用丙酮提取法测定藻液叶绿素a的含量，并利用血球计数法测定藻细胞数。判断菌种是否有溶藻效果。经过反复实验，最终筛选出一株有溶藻效果的菌种(菌株b)，并将筛选得到的纯细菌用甘油保藏法保存在-80℃冰箱。
39.其中，制备藻液所用的藻种为铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)fachb-315，购于中国科学院淡水藻种库，培养条件为：bg-11培养基，光照强度为2500lux，光暗周期比为12h/12h，温度为25
±
1℃，培养至对数生长期。bg11培养基的配方为：nano
3 1.500g、k2hpo
4 0.040g、mgso4·
7h2o 0.075g、cacl2·
2h2o 0.036g、citric acid 0.006g、ferric ammonium citrate 0.006g、edta na
2 0.001g、na2co
3 0.020g、a5+co solution 1.000ml、distilled water 919.000ml。其中，a5+co solution的主要配方为：h3bo
3 2.860g、mncl2·
4h2o 1.810g、znso4·
7h2o 0.222g、na2moo4·
2h2o 0.079g、cuso4·
5h2o 0.390g、co(no3)2·
6h2o 0.049g、distilled water 1000.000ml，用1mol/l的hcl和naoh将ph调至7.1。
40.利用丙酮萃取法测定样品中叶绿素a的含量的方法为：取5ml待测藻液，用直径50mm的0.45um水系滤膜减压过滤，将滤膜取下放入研钵中，加入0.2g碱式碳酸镁，移取3ml左右80％丙酮溶解滤膜及藻渣，研磨3分钟，用丙酮润洗研钵3次，将液体倒入50ml离心管中，在4000rpm/min下离心10分钟。将离心后的上清液移入10ml比色管中，并用80％丙酮定容至10ml。然后分别在750nm、663nm、645nm、630nm下测其吸光度，并以80％丙酮为空白组，
最后将吸光度值代入叶绿素a计算公式(2-1)中算出其浓度，并计算其抑制率(％)。
[0041][0042]
式中：v—水样体积(l)；
[0043]
d—吸光度；
[0044]
v1—提取液定容后体积(ml)；
[0045]
δ—比色皿光程(cm)；
[0046]
抑制率(％)＝(1-实验组叶绿素a含量/空白组叶绿素a含量)
×
100。
[0047]
对筛选后的纯化菌株b委托测序公司进行基因鉴定，并用sanger法进行菌种鉴定得到细菌的基因片段测序结果(16srdna)。结果表明菌株b为蜡样芽孢杆菌属(bacillus cereus)，将其名称为bacillus cereus b1-xl001。
[0048]
16srdna(seq id no:1)：
[0049]
acatgcaagtcgacgcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgaacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagctcgtaaaactctgttgttagggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaatgtgtagcggtgaaaacgatgagtgctaagtgttagaaggtttcgccccttagttgctgaaatgcccaagcggttgagcctggtgtttaaatcggagcaacgggaagaaccctaaccggttgttgttaagttgggttaagttgggttgtgagaaggtggggtaaattccgcaacgagggccacccttaaggagtcaaattctcctgccccttatggcctggggtacccccctggttccaagggctgcaaattgcctaccagaaagcggaattggttgttattggggatcagccaggcgcgggggtaaccttttggagcc。
[0050]
随后，于2017年9月24日将菌株b1-xl001送至广东省微生物菌种保藏中心进行保藏，并经保藏中心于2017年9月28日检测确认该菌株为存活菌株，菌株的分类学名称为bacillus cereus(蜡样芽孢杆菌)，保藏名称为bacillus cereus b1-xl001，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为：gdmcc no:60245。
[0051]
最后，将蜡样芽孢杆菌菌株b1-xl001接种于新鲜的lb平板上，37℃培养2-3d后观察菌落形态。如图1的扫描电镜结果所示，细菌呈长杆状，大小约1.0umx2.5-4.0um。如图2所示，菌株b1-xl001的菌落呈白色，不透明，菌落呈圆形，边缘规则，表面光滑，湿润。
[0052]
同时，对菌株b1-xl001进行培养和生长曲线测定：从-80℃冰箱取出保藏的菌株b1-xl001，吸取20μl接种于固体lb培养基中活化8小时，然后挑取菌落于20ml新鲜无菌的液体lb培养基中，然后置于37℃、150r/min下进行培养，并每隔2h取样测定其在600nm处的吸光度(od
600
)，以od
600
表征其生长情况，便于后续实验取样。如图3所示，菌株b1-xl001经过2h左右的适应期后进入对数期，3-10h生长速率最快，12-28h速率变慢，大约在20h进入稳定期，并持续至35h，35h后开始衰亡。该菌株的延迟期短，生长速率快，对数期较长。用平板涂布计数法得知该细菌在12h时的生物量为1.0
×
109，可见，蜡样芽孢杆菌b1-xl001能在较短时间内达到较大生物量。
[0053]
实施例2蜡样芽孢杆菌菌株b1-xl001对铜绿微囊藻的溶藻方式研究
[0054]
制备藻液所用的藻种为铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)fachb-315，购于中国科学院淡水藻种库，培养条件为：bg-11培养基，光照强度为2500lux，光暗周期比为12h/12h，温度为25
±
1℃，培养至对数生长期。
[0055]
具体试验方法为：将b1-xl001细菌于37℃、150r/min条件下用lb液体培养基培养至od
600
＝0.8-1.0得到b1-xl001发酵液，然后根据表1对菌株培养液进行处理，共设置5个试验组(实验组c-f)，并设置两对照(空白组a、b)，来探究b1-xl001细菌对铜绿微囊藻的溶藻方式，每组实验设3组平行，并于第0、4、8、12天取样，采用丙酮提取法测定藻液叶绿素a的含量，计算其抑制率，并利用血球计数法测定藻细胞数。
[0056]
表1 b1-xl001菌液的不同处理方式
[0057][0058][0059]
如图4所示，第12天时，实验组c(b1-xl001菌液)、实验组d(b1-xl001菌体+新鲜lb培养基重悬液)和实验组f(b1-xl001菌滤液)对铜绿微囊藻的抑制率分别为93.90
±
0.30％、93.17
±
0.50％和79.64
±
1.49％。而实验组e(b1-xl001菌体+bg-11培养基重悬液)在第12天时的抑制率仅为14.65
±
2.64％。说明蜡样芽孢杆菌b1-xl001的菌液有极强的溶藻效果，且该菌是间接或直接的溶藻模式，但主要依靠分泌胞外物质进行溶藻，在12天的溶藻过程中，能持续降低叶绿素a含量和藻细胞数。
[0060]
此外，对实验组c的菌液抑制铜绿微囊藻的过程进行肉眼表观观察和投射电镜观察其结果分别如图5、图6所示。其中，图5为菌株b1-xl001对铜绿微囊藻的溶藻显微图；图6为菌株b1-xl001对铜绿微囊藻的不同时期溶藻效果图。
[0061]
如图5和6所示，第0天时铜绿微囊藻液呈绿色，藻细胞完整，具有三层细胞壁结构
(凝胶质层、细胞壁和细胞膜)，细胞壁与膜结合紧密，类囊体排列紧密,均匀分布在细胞质中。而在添加蜡样芽孢杆菌菌株b1-xl001抑制铜绿微囊藻第4天时，藻液出现褪色，呈黄绿色，藻细胞的细胞外膜结构变得不规则，明显皱缩，且三层细胞壁结构变得松散，藻细胞的类囊体崩解且排列不规则。第8天时，藻细胞明显畸形，类囊体膜明显消失，细胞壁和细胞膜的完整性被破坏，并出现部分破裂并溶解的现象，藻细胞已经坏死。第12天时，藻液几乎完全褪去绿色，透明、澄清，观察到藻细胞的dna核物质和多聚磷酸盐等营养物质颗粒被降解，藻细胞壁严重破裂，大量的细胞内部物质流出，藻细胞已经死亡。
[0062]
实施例3蜡样芽孢杆菌菌株b1-xl001对铜绿微囊藻的趋化性
[0063]
将b1-xl001细菌于37℃、150r/min条件下用lb液体培养基培养至od
600
＝0.8-1.0，8000r/min离心10min，收集沉淀菌体，用无菌水反复清洗3次，后加入等体积新鲜lb培养基重悬制成菌悬液。向bg-11培养基中加入0.3％琼脂，然后于121℃下灭菌30分钟制备bg-11半固体培养基。当bg-11半固体培养基冷却至室温后，将5ml菌悬液混合在bg-11半固体培养基中，然后使用倾注平板法制备带有细菌细胞的琼脂平板。铜绿微囊藻在bg-11培养基上培养至对数生长期后，取20ml在20℃下以4000r/min离心10分钟，弃上清液，加入50微升bg-11液体培养基重悬藻体沉淀制成重悬藻液，然后吸取重悬藻液滴于上述平板中央，在琼脂培养基上于37℃培养2天后，在藻类周围观察是否有趋化环。
[0064]
如图7所示，以铜绿微囊藻液为中心，形成了一个明显的趋化环。说明蜡样芽孢杆菌菌株b1-xl001感知到铜绿微囊藻的趋化信号后，表现出很强的趋化能力，可以附着在藻细胞上。
[0065]
实施例4蜡样芽孢杆菌菌株b1-xl001的溶藻稳定性测试
[0066]
(1)温度稳定性测定：为评估蜡样芽孢杆菌菌株b1-xl001分泌的溶藻化合物的温度耐受性，将b1-xl001细菌于37℃、150r/min条件下用lb液体培养基培养至od
600
＝0.8-1.0，然后取b1-xl001的上清液分别在60℃、80℃、100℃水浴1h，在-20℃、4℃冷冻1h，以37℃处理为对照，实验组恢复室温后将各处理液按2.0％的体积比接种于藻液(bg-11培养基上培养至对数生长期)中进行溶藻活性检测，以加入等体积lb培养基的藻液为空白组，在第0、4、8、12天测定叶绿素a含量和藻细胞数。
[0067]
如图8所示，在-20℃-100℃的温度区间内，蜡样芽孢杆菌b1-xl001分泌的溶藻物质均有极显著的溶藻效果，溶藻物质有很好的温度稳定性。
[0068]
(2)酸碱稳定性的测定：分别取5mlb1-xl001菌液(37℃、150r/min条件下用lb液体培养基培养至od
600
＝0.8-1.0)，共取4份，分别调ph至11、9、7、3(原菌液ph＝5)，室温放置2h后再回调至原始ph，然后将各处理液按2.0％的终浓度接种到藻液(bg-11培养基上培养至对数生长期)中进行溶藻活性检测，以加入等体积lb培养基的藻液为空白组，在第0、4、8、12天测定叶绿素a含量和藻细胞数。
[0069]
如图9所示，在蜡样芽孢杆菌b1-xl001滤液的ph＝3的情况下，抑制率达到60.03
±
0.16％，与空白组构成极显著差异，说明滤液有酸稳定性，可耐强酸，但不耐强碱。
[0070]
(3)反复冻融稳定性测定：分别取5mlb1-xl001菌液(37℃、150r/min条件下用lb液体培养基培养至od
600
＝0.8-1.0)，共取3份，分别置于液氮中进行冷冻处理，再在室温下融化0、3、6次，然后将各处理液按2.0％的终浓度接种到藻液(bg-11培养基上培养至对数生长期)中进行溶藻活性检测，以加入等体积lb培养基的藻液为空白组，在第0、4、8、12天测定叶
绿素a含量和藻细胞数。
[0071]
如图10所示，经反复多次冻融后，溶藻物质对铜绿微囊藻的抑制率仍可达到90％以上，说明反复多次冻融不会影响溶藻物质的活性，说明蜡样芽孢杆菌b1-xl001分泌的溶藻物质具有良好的稳定性。
[0072]
实施例5蜡样芽孢杆菌菌株b1-xl001的实际应用
[0073]
在广州华南理工大学附近穗石村的一处富营养化池塘(图11)中取10升富含铜绿微囊藻的水体，将水样平均分成10份(每份1升)后放置在阳光充足的地方，然后在各水样中加入2％体积比的菌液(于37℃、150r/min条件下用lb液体培养基培养至od
600
＝0.8-1.0)，并在第0、4、8、12天测定叶绿素a。
[0074]
如图12和13所示，蜡样芽孢杆菌b1-xl001能显著降低富营养化水体的叶绿素a含量，絮凝并沉淀藻细胞，降低水质的浊度，且具有较好的稳定性。
[0075]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。