一株枯草芽孢杆菌BS168感受态工程菌株及其应用

comk重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
10.(1)构建pdg1730-p
grac-phesm重组质粒，转化枯草芽孢杆菌bs168，得到枯草芽孢杆菌bs168-spc-phesm；
11.(2)构建无抗性标签的pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒，转化枯草芽孢杆菌bs168-spc-phesm；
12.(3)筛选4cp抗性阳性菌株，即为枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株。
13.在本发明的一些实施方式中，所述pdg1730-p
grac-phesm重组质粒中的phesm基因的核苷酸序列如seq id no：7所示。
14.在本发明中，所述phesm基因是经密码子优化后得到的。其中，用于扩增该phesm基因的扩增引物为：
15.上游phesm-f：5
’‑
cccatataaaggaggaaggatccatggaagaaaagttaaagcaac-3’和下游phesm-r：5
’‑
acggatatcatcatcgctcatattaagcttgcttgaactgact-3’。
16.在本发明的一些实施方式中，所述抗性标签包括氨苄青霉素抗性标签、壮观霉素抗性标签和氯霉素抗性标签。
17.在本发明的一些优选实施方式中，所述抗性标签为壮观霉素抗性标签。
18.在本发明的一些实施方式中，所述pdg1730-p
grac-phesm重组质粒是通过将pdg1730线性化片段、p
grac
扩增片段和phesm扩增片段进行多片段连接和环化得到的。其中，对于核酸片段的连接和环化可通过本领域常规的试剂盒或常规方法实现，包括但不限于多片段无缝克隆试剂盒。
19.在本发明的一些优选实施方式中，pdg1730线性化片段是以pdg1730质粒为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：上游pdg1730-f：5
’‑
atgagcgatgatgatatccgt-3’和下游pdg1730-r：5
’‑
gtcgagatccccctatgcaa-3’。
20.在本发明的一些优选实施方式中，p
grac
扩增片段是以pht254质粒为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：上游pgrac-f：5
’‑
ttgcatagggggatctcgaccggaaggaaatgatgacctc-3’和下游pgrac-r：5
’‑
ggatccttcctcctttatatggg-3’。
21.在本发明的一些实施方式中，所述无抗性标签的pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒是通过将pdg1730(δspc)线性化片段、p
xyla
扩增片段、comk扩增片段进行多片段连接和环化得到的。其中，对于核酸片段的连接和环化可通过本领域常规的试剂盒或常规方法实现，包括但不限于多片段无缝克隆试剂盒。
22.在本发明的一些优选实施方式中，pdg1730(δspc)线性化片段是以pdg1730质粒为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：上游pdg1730(δspc)-f：5
’‑
atgagcgatgatgatatccgtt-3’和下游pdg1730(δspc)-r：5
’‑
tcacgaacgaaaatcgccat-3’。
23.在本发明的一些优选实施方式中，p
xyla
扩增片段是以枯草芽孢杆菌bs168基因组dna作为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：上游pxyla-f：5’aatggcgattttcgttcgtgagcgatatccacttcatccact-3’和下游pxyla-r：5’catattatggcctccttaaaaataaattcattcaaatac-3’。
24.在本发明的一些优选实施方式中，comk扩增片段是以枯草芽孢杆菌bs168基因组dna作为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：上游comk-f：5
’‑
tttttaaggaggccataatatgagtcagaaaacagacgcacc-3’和下游comk-r：5
’‑
aacggatatcatcatcgctcatctaataccgttccccga
gc-3’。
25.本发明的第三个方面，提供一种细胞产品，所述产品中含有本发明第一个方面所述的枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株。
26.在本发明的一些实施方式中，所述细胞产品包括细胞(或菌)悬液、冻干或其他常规形式。
27.本发明的第四个方面，提供本发明第三个方面所述细胞产品在制备食品、药品或化妆品中的应用。
28.本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株在构建枯草芽孢杆菌重组菌株中的应用。
29.在本发明中，发明人通过试验验证上述枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株可以作为一种优良工程菌株的原始菌株使用，因此，基于该枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株为模板进行基因的改良以获得效果相似的枯草芽孢杆菌重组菌株是完全可以预期的。
30.本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株在构建质粒转化载体和基因改造中的应用。
31.在本发明中，发明人通过试验验证上述枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株可以作为一种优良工程菌株的原始菌株使用，且具有较好的质粒转化和基因重组功能，因此，使用该枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株为质粒载体转化各类质粒以获得高转化率的目标菌株是完全可以预期的。
32.本发明的有益效果是：
33.1.本发明在枯草芽孢杆菌野生菌bs168基因组amye位点处插入p
xyla-comk基因盒，在不引入抗性基因的情况下，人为控制bs168野生菌株成为感受态细胞，并通过超低温保存，维持感受态状态，极大地简化了对野生菌bs168的改造过程，降低了改造成本。
34.2.本发明中的枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株相比bs168野生菌株具有更强的质粒转化效果和片段重组能力，能够兼容各类不同的位点重组，且由于其改造程度低，因此，可作为一种优良工程菌株的原始菌株使用。
附图说明
35.图1为pdg1730-p
grac-phesm重组质粒的构建流程示意图。
36.图2为bs168-spc-phesm重组菌株与野生菌在lb-4cp固体培养基的生长图。
37.图3为bs168-spc-phesm重组菌株的扩增产物凝胶电泳图，条带a为扩增产物。
38.图4为pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒的构建流程示意图。
39.图5为pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒的扩增产物凝胶电泳图，条带b为扩增产物。
40.图6为bs168-p
xyla-comk重组菌株的扩增产物凝胶电泳图，条带c为未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株的扩增产物，条带d为bs168-p
xyla-comk重组菌株的扩增产物。
41.图7为bs168-p
xyla-comk重组菌株的构建原理示意图。
42.图8为枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株在amye位点重组功能验证结果，其中，a为未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株在spc抗性平板上的生长情况，b为枯草芽
孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株在spc抗性平板上的生长情况，c为bs168-p
xyla-comk重组菌株使用amye 2-f和amye 2-r的扩增产物凝胶电泳图。
43.图9为枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株在upp位点重组功能验证结果，其中，a为未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株在cm抗性平板上的生长情况，b为枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株在cm抗性平板上的生长情况，c为bs168-p
xyla-comk重组菌株使用upp1-f和upp2-r的扩增产物凝胶电泳图。
44.图10为枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株的质粒转化功能验证结果，其中，a为未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株与空白pht254转化bs168-p
xyla-comk重组菌株在cm抗性平板上的生长情况对比；b为未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株与空白pht43转化bs168-p
xyla-comk重组菌株在cm抗性平板上的生长情况对比。
具体实施方式
45.为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
46.所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
47.试验材料
48.在下述实施例中，所用的2
×
yt液体培养基的组成为：胰蛋白胨16g\l，酵母提取物10g\l，氯化钠5g\l。制备方法为：混合上述组分，在121℃灭菌20min，即得。
49.所用的lb固体培养基的组成为：胰蛋白胨10g\l，酵母提取物5g\l，氯化钠5g\l，琼脂粉15g\l。制备方法为：混合上述组分，在121℃灭菌20min，即得。
50.所用的lb-4cp固体培养基的组成为：胰蛋白胨10g\l，酵母提取物5g\l，氯化钠5g\l，4-氯苯丙氨酸4g\l、琼脂粉15g\l。制备方法为：混合上述组分，在121℃灭菌20min，即得。
51.所用的电穿孔缓冲液的组成为：0.5m海藻糖，0.5m山梨醇，0.5m甘露醇，0.5mm mgcl2，0.5mm k2hpo4，0.5mm kh2po4。
52.所用的质粒提取试剂盒、细菌dna提取试剂盒以及胶回收试剂盒均购自广州美基生物科技有限公司；pcr扩增酶预混液试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司；无缝克隆试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司。
53.枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株的制备
54.本发明实施例中的枯草芽孢杆菌bs168感受态工程菌株是一种无抗生素标签且具有超自然转化能力的枯草芽孢杆菌bs168感受态菌株(命名为bs168-p
xyla-comk)。该工程菌株采用基因工程手段，通过在amye位点无痕引入枯草芽孢杆菌感受态形成关键转录因子comk制备得到，该工程菌株可以做到高效、快速和低成本的质粒转化和基因编辑，且无抗性标签。
55.(1)构建pdg1730-p
grac-phesm重组质粒：
56.根据现有数据库中公开的p
grac
、phesm基因序列，设计具有对应同源序列的引物，分别进行扩增。同时，针对pdg1730质粒(枯草芽孢杆菌整合载体pdg1730，购自武汉淼灵生物科技有限公司)设计引物，扩增pdg1730线性化片段。
57.具体引物序列如下：
58.在本实施例中，pdg1730线性化片段是以pdg1730质粒为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：
59.上游pdg1730-f：5
’‑
atgagcgatgatgatatccgt-3’(seq id no：1)；
60.下游pdg1730-r：5
’‑
gtcgagatccccctatgcaa-3’(seq id no：2)。
61.在本实施例中，p
grac
扩增片段是以pht254质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司)为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：
62.上游pgrac-f：5
’‑
ttgcatagggggatctcgaccggaaggaaatgatgacctc-3’(seq id no：3)；
63.下游pgrac-r：5
’‑
ggatccttcctcctttatatggg-3’(seq id no：4)。
64.在本实施例中，phesm扩增片段是以密码子优化后的phesm基因序列作为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：
65.上游phesm-f：5
’‑
cccatataaaggaggaaggatccatggaagaaaagttaaagcaac-3’(seq id no：5)；
66.下游phesm-r：5
’‑
acggatatcatcatcgctcatattaagcttgcttgaactgact-3’(seq id no：6)。
67.扩增得到的phesm扩增片段的核苷酸序列为：5
’‑
atggaagaaaagttaaagcaacttgaacaagaagcgcttgagcaagtcgaagccgccagcagtttgaaagttgtgaacgacatcagagtccagtatcttggtaagaagggccctatcactgaagtcctgcggggaatgggcaaattaagcgcagaggaaagacctaagatgggcgccttggcaaacgaagtacgtgagagaatagcaaatgcgatagcagataaaaacgagaagttggaggaggaggagatgaaacaaaaactggcaggtcagacaatagatgtaacccttccgggcaaccctgtggcagttgggggacgccatccgctcacggtggtcattgaagagatagaagacttattcattggtatgggatatacagttgaagaaggacctgaagtagaaacagattactataacttcgagagtcttaatttaccaaaagagcatccagcacgcgacatgcaagactccttctacattacggaagagaccctcatgcgtacacagacaagtccagttcagactcgcacaatggagaaacacgaaggcaaaggcccggtgaaaataatttgtccaggaaaagtttaccggcgggacaatgatgatgcaactcattcacatcagtttatgcagatcgagggattggttgttgataaaaacatctcaatgagtgacctcaagggtaccttagaattagtggctaaaaaaatgtttggacaggacagagagatccgcctgagaccatccttctttccttttactgagccgtcagttgaagttgatgtgacttgcttcaaatgcggcggcaacggctgctcagtctgtaaaggcaccggatggatagagattttgggggccggcatggtacatccgaacgtgctgaaaatggcagggttcgatccgaaagagtatcagggatttggctttggaatgggagtggagcgcatagctatgctgaagtatggaattgatgatattcgccatttctatacgaatgacgtccgcttcattagtcagttcaagcaagcttaa-3’(seq id no：7)。
68.使用多片段无缝克隆试剂盒，对上述步骤得到的pdg1730线性化片段、p
grac
扩增片段和phesm扩增片段进行多片段连接和环化，得到pdg1730-p
grac-phesm重组质粒，流程示意图如图1所示。
69.(2)pdg1730-p
grac-phesm重组质粒的转化、提取与鉴定：
70.将步骤(1)所得到的pdg1730-p
grac-phesm重组质粒转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，从中挑选阳性转化子进行扩大培养，提取质粒，测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒置于-20℃保存备用。
71.(3)pdg1730-p
grac-phesm重组质粒转化枯草芽孢杆菌bs168菌株：
72.将步骤(2)得到的pdg1730-p
grac-phesm重组质粒通过电击转化枯草芽孢杆菌bs168菌株(购自北纳生物科技有限公司)，筛选具有壮观霉素(spc)抗性的阳性菌株，并利用4-氯苯丙氨酸(4cp)测定phesm基因在阳性菌株中的功能性，经测序验证正确且phesm基因功能正常的阳性菌株(bs168-spc-phesm)进行-80℃甘油保种。
73.具体步骤为：
74.取枯草芽孢杆菌bs168，在2
×
yt培养基中培养过夜。将过夜培养的菌液用新鲜的2
×
yt培养基进行100倍稀释，培养至od600为0.8。加入质量比为1％dl-苏氨酸、2％甘氨酸、0.1％色氨酸和0.03％tween 80，摇菌2h，然后置于冰上冷却15min。4000
×
g离心10min。弃上清，用电穿孔缓冲液重悬，6000
×
g离心10min，重复3次。用少量电穿孔缓冲液重悬。吸取100μl重悬液，加入2μlpdg1730-p
grac-phesm重组质粒(100ng/μl)，进行电击转化(电击条件为1250v/mm，200ω，25μf)。转化完成后立即加入1ml添加有0.5m山梨醇和0.38m甘露醇的2
×
yt培养基，37℃，200rpm，摇菌3h，涂布于spc抗性筛选lb固体培养基中进行筛选。筛选情况如图2所示。
75.可以发现，阳性bs168-spc-phesm重组菌株无法在lb-4cp固体培养基上生长，而未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株则可以生长。
76.阳性bs168-spc-phesm重组菌株的验证采用pcr扩增来实现，所用引物为：
77.上游amye 1-f：5
’‑
ggaagggaatcaaggagataaaag-3’(seq id no：8)；
78.下游amye 1-r：5
’‑
caggataaagcacagctacagac-3’(seq id no：9)。
79.pcr扩增产物使用凝胶电泳验证条带大小，结果如图3所示。图3中，条带a为上述引物的扩增产物，片段大小3100bp。
80.(4)构建pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒：
81.设计具有对应同源序列的引物，分别扩增得到p
xyla
扩增片段、comk扩增片段以及无壮观霉素(spc)抗性标签的pdg1730线性化片段(pdg1730(δspc))。
82.具体引物序列如下：
83.在本实施例中，pdg1730(δspc)线性化片段是以pdg1730质粒为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：
84.上游pdg1730(δspc)-f：5
’‑
atgagcgatgatgatatccgtt-3’(seq id no：10)；
85.下游pdg1730(δspc)-r：5
’‑
tcacgaacgaaaatcgccat-3’(seq id no：11)。
86.在本实施例中，p
xyla
扩增片段是以枯草芽孢杆菌bs168基因组dna作为模板(提取自上述枯草芽孢杆菌bs168菌株)扩增得到的，其中，扩增引物为：
87.上游pxyla-f：5
’‑
aatggcgattttcgttcgtgagcgatatccacttcatccact-3’(seq id no：12)；
88.下游pxyla-r：5
’‑
catattatggcctccttaaaaataaattcattcaaatac-3’(seq id no：13)。
89.在本实施例中，comk扩增片段是以枯草芽孢杆菌bs168基因组dna作为模板(提取自上述枯草芽孢杆菌bs168菌株)扩增得到的，其中，扩增引物为：
90.上游comk-f：5
’‑
tttttaaggaggccataatatgagtcagaaaacagacgcacc-3’(seq id no：14)；
91.下游comk-r：5
’‑
aacggatatcatcatcgctcatctaataccgttccccgagc-3’(seq id no：
15)。
92.使用多片段无缝克隆试剂盒，对上述步骤得到的pdg1730(δspc)线性化片段、p
xyla
扩增片段、comk扩增片段进行多片段连接和环化，得到pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒，流程示意图如图4所示。
93.(5)pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒的转化、提取与鉴定：
94.将步骤(4)所得到的pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，从中挑选阳性转化子进行扩大培养，提取质粒，测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒置于-20℃保存备用。
95.其中，图5为pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒中部分dna序列pcr验证产物凝胶电泳图，条带b为重组质粒pdg1730(δspc)-p
xyla-comk的验证条带，片段大小为946bp。
96.扩增引物为：
97.上游pxyla-comk-f：5
’‑
cattgaatgacggggcagac-3’(seq id no：16)。
98.上游pxyla-comk-r：5
’‑
gactcttcatcatcattggc-3’(seq id no：17)。
99.(6)pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒转化bs168改造菌株：
100.将步骤(5)得到的pdg1730(δspc)-p
xyla-comk重组质粒通过电击转化至bs168-spc-phesm重组菌株(步骤(3)中获得的阳性菌株)中，筛选具有4cp抗性的阳性菌株(phesm基因产生，如果phesm基因被修复模板替代，则可以在4cp培养基上生长)，经测序验证正确的4cp抗性阳性的菌株即为枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株。-80℃甘油保种。
101.具体操作步骤同步骤(3)，其中，在本实施例中，验证引物为：
102.上游amye 2-f：5
’‑
gttgacgcggtcatcaatc-3’(seq id no：18)；
103.下游amye 2-r：5
’‑
tgtccagccatcacattgtg-3’(seq id no：19)。
104.pcr扩增产物使用凝胶电泳验证条带大小，结果如图6所示。图6中，条带c为未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株基于上述引物的扩增产物，大小为750bp；条带d为bs168-p
xyla-comk重组菌株基于上述引物的扩增产物，大小为1364bp。
105.其中，所得枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株的基因序列为：5
’‑
atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctgtttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgctgaaacggcgaacaaatcgaatgagcttacagcaccgtcgatcaaaagcggaaccattcttcatgcatggaattggtcgttcaatacgttaaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagccattcagacatctccgattaaccaagtaaaggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtactggctgtatcagccgacatcgtatcaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaatttaaagaaatgtgtgcagccgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtcatcaatcataccaccagtgattatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaactggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgatgggatgtcacgcagaattcattgctcgggctgtatgactggaatacacaaaatacacaagtacagtcctatctgaaacggttcttagacagggcattgaatgacggggcagacggttttcgatttgatgccgccaaacatatagaggcgatatccacttcatccactccatttgtttaatctttaaattaagtatcaacatagtacatagcgaatcttccctttattatatctaatgtgttcataaaaaactaaaaaaaatattgaaaatactgacgaggttatataagatgaaaataagttagtttgtttaaacaacaaactaataggtgatgtacttactatatgaaataaaatgcatctgtatttgaatgaatttatttttaaggaggccataatatgagtcagaaaacagacgcacctttagaatcgtatgaagtgaacggcgcaacaattgccgtgctgccagaagaaatagacggcaaaatctgttccaaaattattgaaaaagattgcgtgttttatgtaaacatgaagccgctgcaaattg
tcgacagaagctgccgattttttggatcaagctatgcgggaagaaaagcaggaacttatgaagtgacaaaaatttcacacaagccgccgatcatggtggacccttcgaaccaaatctttttattccctacactttcttcgacaagaccccaatgcggctggatttcccatgtgcatgtaaaagaattcaaagcgactgaattcgacgatacggaagtgacgttttccaatgggaaaacgatggagctgccgatctcttataattcgttcgagaaccaggtataccgaacagcgtggctcagaaccaaattccaagacagaatcgaccaccgcgtgccgaaaagacaggaatttatgctgtacccgaaagaagagcggacgaagatgatttatgattttattttgcgtgagctcggggaacggtattagacggacaagctagtgacatgggtagagtcgcatgatacgtatgccaatgatgatgaagagtcgacatggatgagcgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggcagtacgcctcttttcttttccagacctgagggaggcggaaatggtgtgaggttcccggggaaaagccaaataggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtcaatagatttcacaatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccgaatggaaacaaccagatatttatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgcaggttcatcctctgtctctatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaataaagctggagcgggttcatttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctgtagctgtgctttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgagaattacaaaacaggtgtaacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgcagatgcgaatacaacaaaagccgtttatcaaatcaataatggaccagagacggcgtttaaggatggagatcaattcacaatcggaaaaggagatccatttggcaaaacatacaccatcatgttaaaaggaacgaacagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaagagatccagcgtcggccaaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaatgcttatatctataaacatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctggaaaaccaatgactaaaaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacggatacaaccaacgcaaaagtgatttttaataatggcagcgcccaagtgcccggtcagaatcagcctggctttgattacgtgctaaatggtttatataatgactcgggcttaagcggttctcttccccattga-3’(seq id no：20)。
106.上述步骤中的重组菌株构建原理示意图如图7所示。
107.枯草芽孢杆菌bs168-p
xyla-comk重组菌株的重组效率的验证
108.(1)amye位点重组功能验证：
109.取上述bs168-p
xyla-comk重组菌株接种于2
×
yt培养基中，37℃、220r/min过夜培养。将过夜培养的菌液用新鲜的2
×
yt培养基进行100倍稀释，37℃、220r/min摇菌培养至od600为2.0。加入质量比为1.5％的木糖，用新鲜的2
×
yt培养基稀释菌液至od600＝1.0。37℃、220r/min培养2h，得到感受态细胞溶液。取2μl浓度为200ng/μl的pdg1730质粒，加至100μl的感受态细胞溶液中，混合均匀，37℃、220r/min孵育90min，涂布在spc(140μg/ml)抗性平板上，37℃倒置过夜培养，筛选阳性菌落。以未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株作为对照。
110.同时，使用amye 2-f和amye 2-r进行pcr扩增验证。
111.结果如图8所示。
112.可以发现，bs168-p
xyla-comk重组菌株在amye位点的同源重组效率明显高于未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株，且凝胶条带结果也印证了其在amye位点的同源重组成功(图8c，片段大小1529bp)。
113.(2)upp位点重组功能验证：
114.构建pmd19t-upp-cm验证质粒：设计具有对应同源序列的引物，分别扩增得到upp上游基因(upp-up)扩增片段、upp下游基因(upp-down)扩增片段、和氯霉素(cm)基因扩增片
段。
115.具体引物序列如下：
116.在本实施例中，upp上游基因(upp-up)扩增片段是以枯草芽孢杆菌bs168基因组dna为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：
117.上游upp1-f：5
’‑
cggtgaagtattgcaggacg-3’(seq id no：21)；
118.下游upp1-r：5
’‑
ccgtatatatgtcagcttgtgc-3’(seq id no：22)。
119.在本实施例中，upp下游基因(upp-down)扩增片段是以枯草芽孢杆菌bs168基因组dna为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：
120.上游upp2-f：5
’‑
gatatttacattgcggcgctag-3’(seq id no：23)；
121.下游upp2-r：5
’‑
ccataacccagtacatacactgcc-3’(seq id no：24)。
122.在本实施例中，氯霉素(cm)基因扩增片段是以质粒pht254为模板扩增得到的，其中，扩增引物为：
123.上游cm-f：5
’‑
acaagctgacatatatacggcggcaatagttacccttatt-3’(seq id no：25)；
124.下游cm-r：5
’‑
agcgccgcaatgtaaatatctgtggataaccgtattaccg-3’(seq id no：26)。
125.通过重叠pcr的方法连接三个片段，并将其连接至pmd19-t质粒(购自上海百赛生物技术股份有限公司)中，得到pmd19t-upp-cm质粒，使用该质粒进行bs168-p
xyla-comk重组菌株转化、重组验证。具体步骤为：取2μl浓度为200ng/μl的pmd19t-upp-cm质粒加至100μl的感受态细胞溶液中，混合均匀，37℃、220r/min孵育90min，涂布在cm(10μg/ml)抗性平板上，37℃倒置过夜培养，筛选阳性菌落。以未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株作为对照。
126.同时，使用upp1-f和upp2-r进行pcr扩增验证。
127.结果如图9所示。
128.可以发现，bs168-p
xyla-comk重组菌株在upp位点的同源重组效率明显高于未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株，且凝胶条带结果也印证了其在upp位点的同源重组成功(图9c，片段大小2396bp)。
129.(3)质粒转化功能验证：
130.在本实施例中，分别以空白pht254(来源同上述实施例)和空白pht43(购自武汉淼灵生物科技有限公饲)作为测试质粒，检测bs168-p
xyla-comk重组菌株的质粒转化能力。
131.具体步骤为：取2μl浓度为200ng/μl的质粒溶液(空白pht254或空白pht43)加至100μl的bs168-p
xyla-comk重组菌株(感受态)溶液中，混合均匀，37℃、220r/min孵育90min，涂布在cm(10μg/ml)抗性平板上，37℃倒置过夜培养，筛选阳性菌落。以未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株作为对照。
132.结果如图10所示。
133.可以发现，bs168-p
xyla-comk工程菌株感受态细胞的质粒转化能力明显高于未经重组的枯草芽孢杆菌bs168标准菌株。
134.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。