分离的益生菌被膜及其应用的制作方法

本发明涉及酶制剂领域，具体涉及结合有营养素水解酶的益生菌被膜的制备方法及其应用。

背景技术：

1、牛乳是一种优质的营养食品，含有人体所必须的所有种类的氨基酸，能满足人体对蛋白营养的需求。尽管如此，牛乳与人乳之间的差异还是非常显著的，比如说牛乳中酪蛋白与乳清蛋白的含量比为8:2，而人乳中则为4:6。对人类健康影响最大的是牛乳中的αs-酪蛋白和β-乳球蛋白，它们是牛乳中主要的蛋白成分，在人乳中却不存在。这两种蛋白是牛乳中最重要的过敏原，在5-15％的婴幼儿中引起牛乳不耐受或过敏症状。为了解决牛乳不耐受问题，通常的做法是将牛乳中蛋白进行水解，降低蛋白过敏原的含量，抑制致敏作用，以制备具有低致敏性的婴儿配方奶粉。

2、除了制备低致敏性婴儿配方奶粉以外，水解牛乳蛋白还被应用于以下场景中。1)生物活性肽的制备：以牛乳酪蛋白为原料，水解制备多种生物活性肽，比如血管紧张素转化酶(ace)抑制肽。2)部分水解乳蛋白的制备：以牛乳酪蛋白和乳清蛋白为原料，水解制备易消化的部分水解乳蛋白产品。

3、血管紧张素转化酶(ace)抑制肽，是现阶段人们较为关注的一个来源于乳蛋白的生物活性肽品种。ace又称为激肽酶ⅱ或肽基-羧基肽酶，是一种存在于血管内皮细胞表面的膜结合糖蛋白，广泛分布于人体组织中。ace附着于血管内皮细胞的表面，可被分解释放进入血液循环，发挥催化血管紧张素ⅰ转化为血管紧张素ⅱ、以及灭活缓激肽的作用。这些重要的生理作用使其成为治疗高血压、心力衰竭、2型糖尿病、肾病的理想靶点。作为具有拮抗作用的小分子肽，ace抑制肽可通过抑制ace的活性，实现调节人体血压的目的。1965年，ferreim首次从巴西蝮蛇蛇毒中分离出ace抑制肽。从那以后，人们就尝试从乳蛋白、植物蛋白、以及海洋生物蛋白等不同来源的蛋白质中分离ace抑制肽，目前该领域的一个热点方向是以牛乳蛋白为原料，水解制备ace抑制肽。

4、此外，部分水解乳蛋白产品作为一种易吸收的蛋白质补充剂，有助于体能的快速恢复和肌肉组织的发育，深受运动员、健身爱好者的喜爱。这种有益的性质使其在临床营养领域也具有非常广阔的应用前景。

5、对以上、以及其他乳蛋白相关的应用而言，优化的乳蛋白水解工艺是产品开发的核心环节。一般来说，蛋白质水解指的是利用水解作用，将完整的蛋白质降解为多肽或氨基酸的过程，水解工艺主要有化学水解、酶水解两种。

6、化学水解是利用强酸、强碱处理，使蛋白质降解为小片段的过程。该工艺过程简单、操作容易，但剧烈的反应条件常会导致氨基酸的结构损伤，比如使l-氨基酸转化成d-氨基酸，形成氯丙醇等有毒物质。

7、与化学水解不同，酶水解通常在较为温和的反应条件下进行，利用蛋白酶降解氨基酸之间的肽键，将蛋白质分解成小分子肽。由于每种蛋白酶都具有较为稳定的降解位点和活性，有利于对水解进程和水解产物的控制，产品的批次稳定性好，能够满足生产的要求。常用的蛋白水解酶有：1)动物来源的蛋自酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶(胰肽酶e)和组织蛋白酶a；2)植物来源的蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋自酶；3)微生物来源的蛋自酶，如枯草杆菌蛋自酶。

8、尽管与化学水解相比，蛋白质的酶水解具备较大优势，但在技术方案上仍然存在一些不足，比如纯化蛋白酶的生产成本高，残留蛋白酶的失活和去除困难，蛋白质水解过程中会产生苦味等。其中，苦味的产生是对工艺过程最为不利的一个方面，不仅影响产品的风味，还制约了水解蛋白的应用。

9、研究发现，苦味的出现是因为水解过程中产生了一类具有疏水性末端氨基酸的多肽。生理状态下，这些疏水性氨基酸多被隐藏在球状蛋白分子的疏水性内核结构中，食用过程中不会接触到味蕾，所以我们感觉不到它们所带来的苦味。在蛋白质的酶水解工艺中，它们被充分地暴露了出来，就会接触到味蕾而产生苦味。随着水解程度加深，更多的疏水性基团被暴露出来，苦味也会随之加重。

10、为了减轻、消除苦味，提高产品品质，通常采用活性炭吸附、乙醇选择性吸附、去苦味酶处理等方法，对蛋白水解产物进行后处理。目前的主流技术是利用去苦味酶处理，最常用的是来源于米曲霉(aspergillus oryzae)的去苦味酶。

11、去苦味酶能够选择性地水解苦味肽末端的疏水性氨基酸，使其游离出来，从而减少这类多肽对味蕾的刺激，降低苦味的程度。尽管去苦味酶处理在一定程度上能够缓解苦味肽对产品品质的影响，但将大量游离氨基酸释放到水解产物中，又会使其出现令人不悦的肉汤样或滑腻的口感。此外，去苦味酶处理还会增加操作步骤、提高工艺成本，并有可能破坏水解产物中重要的生物活性肽。

12、综上所述，在牛乳蛋白质的预消化水解过程中，人们利用来源于动物、植物和微生物的蛋白水解酶，使其降解生成容易消化吸收的一系列短肽。由于所使用的水解酶的切割特性，在该过程中也产生了大量含有疏水性末端氨基酸的苦味肽，对产品品质产生了不利的影响。为了解决苦味肽的问题，人们又引入了去苦味酶处理。去苦味酶处理能够特异地水解苦味肽末端的疏水性氨基酸，降低苦味肽的含量，但由于大量游离氨基酸的释放，又会产生不良的肉汤味口感。这种状况提示我们，牛乳蛋白的预消化领域还存在较大的可改进空间。

技术实现思路

1、微生物发酵是一项应用广泛的食物处理技术。对于乳制品而言，发酵过程也可以理解为其中蛋白质、乳糖等营养成分的预消化过程。以蛋白成分的预消化为例，微生物代谢产生的酶能够降解包括过敏蛋白原在内的蛋白组分，将它们水解为易吸收的短肽或氨基酸，降低牛乳不耐受情况的发生。与蛋白的化学水解、酶水解不同的是，微生物发酵不仅不会产生苦味物质，反而会形成令人愉悦的特殊品质和风味。受到这个现象的启发，发明人认为如果能够将微生物发酵的原理应用于营养成分的预消化，就能解决目前困扰该领域发展的一个瓶颈问题。

2、益生菌是一类对人体健康有益的活性微生物的总称，被广泛应用于食品发酵领域。常用的益生菌有：乳酸菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、益生芽孢杆菌、放线菌、酵母菌(酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属)等类别。在人体体内，益生菌与人体组织具有良好的亲和性，可以定殖于肠道黏膜，改善其中的微生态结构和环境，发挥诸如促进营养物质吸收、调节黏膜与系统免疫功能等有益作用。

3、乳酸菌是一类在食品发酵领域应用最为广泛的微生物，能够通过糖类发酵产生大量的乳酸。乳酸菌广泛地存在于人体内，因为其具有许多有益的代谢特征并为人类长期、安全地使用，被认定为gras级微生物。乳酸菌细胞常呈球状和杆状，常使用的菌种有：保加利亚乳酸杆菌(lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、德氏乳杆菌(lactobacillus delbreckii)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、植物乳酸杆菌(lactobaillus plantarum)、短乳酸杆菌(lactobacillus brevis)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)和乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、戊糖片球菌(pediococcus pentosus)、乳酸片球菌(pediococcus lactis)。

4、在乳酸菌的发酵过程中，其独特的蛋白水解系统发挥了重要的作用。一般认为，乳酸菌的蛋白水解过程分为三个步骤：1)胞外蛋白酶作用阶段，与细胞被膜相关联的蛋白酶将乳蛋白(主要是酪蛋白)水解，生成寡肽；2)跨膜转运段，细胞膜转运系统将寡肽从胞外转运到细胞内；3)内肽酶作用阶段，细胞质内的肽酶将寡肽进一步水解，分解成氨基酸，为细胞生长、代谢提供氮源。

5、与细胞被膜关联的蛋白酶，又被称作cep(cell wall-bound proteinases，cellenvelope-bound proteinases，cell-surface proteinases，cell envelope-associatedproteinases，lactocepins)，cep属于丝氨酸蛋白酶家族成员。通过与细菌细胞壁或其外层的多糖结合，这些蛋白水解酶既可以与细胞膜直接整合，也可以锚定在细胞壁上。本技术书中，发明人将能锚定或结合cep的细胞外层结构统称为“细胞被膜”。

6、乳酸菌发酵过程中，cep水解酪蛋白、乳清蛋白，产生具有独特感官和生物活性的短肽，这种有益的特性使其在酸奶、以及奶酪的生产中得到了广泛的应用。研究发现，来源于不同菌株的cep在生化特性、催化性能方面存在显著的差异，这也使得不同区域的奶制品具有特征性的风味。具有共性的是，不同乳酸菌的发酵都能产生令人愉悦的风味物质，而没有“苦味肽”问题的困扰。

7、利用乳酸菌来源的蛋白酶制备水解蛋白，大体有两个方案。一个方案是从乳酸菌中分离、纯化游离状态的蛋白水解酶，应用于蛋白质原料的水解。考虑到蛋白酶的表达、分离、纯化的工艺较为复杂，游离蛋白酶的价格普遍较高，且酶活力不易保持。在工业化生产中，存在蛋白酶的用量大、生产成本高、以及添加的蛋白酶回收困难等问题。

8、另一个方案是固定化酶方案，该方案对酶活力的保持、以及反应以后酶的回收都非常有利。固定化酶技术开始于二十世纪五十年代，发展至今积累了大量可用于酶固定化的载体，如海藻酸钠、树脂、壳聚糖、纤维素磁性高分子微球等，其中壳聚糖的应用最为广泛。

9、考虑到乳酸菌的蛋白水解酶天然结合于细胞被膜表面这一特性，本发明提出利用物理、化学或生物学方法裂解乳酸菌，获得细菌被膜或部分被膜结构以及其上结合的蛋白水解酶、乳糖水解酶等营养成分降解酶类。以细菌被膜结构作为这些水解酶的天然固定化载体，用于营养成分的预消化过程。

10、多数乳酸菌是安全级的益生菌，将其被膜或被膜的功能性结构应用于营养成分的预消化，在食品安全性方面具有明显的优势。

11、除能够水解蛋白质营养成分以外，本发明提供的技术方案还能用于降解食物中乳糖成分，开发低乳糖乳制品。

12、以上仅是以乳酸菌为例，说明本发明的应用。应当理解，除了乳酸菌以外，本发明提供的技术方案还适用于其他益生菌，包括且不限于乳酸菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、益生芽孢杆菌、放线菌、酵母菌(酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属)等益生菌类别。

13、本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题。

14、1、分离的益生菌被膜在营养成分预消化中的应用。

15、2、段落1所述的益生菌，其特征在于所述益生菌选自乳酸菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、益生芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、以及其经基因工程改造得到的变体中的一种或几种。

16、3、段落2所述的乳酸菌，其特征在于所述乳酸菌选自德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、短乳酸杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳酸乳球菌、以及其经基因工程改造得到的变体中的一种或几种。

17、4、段落1所述的分离的益生菌被膜，其特征在于所述分离的益生菌被膜选自完整的益生菌被膜、部分的益生菌被膜、由益生菌被膜形成的囊泡、益生菌被膜的功能性结构或组分。

18、5、段落1所述的分离的益生菌被膜，其特征在于所述分离的益生菌被膜来源于一种或一种以上的益生菌。

19、6、段落1所述的营养成分，其特征在于所述营养成分选自蛋白质、短肽、多聚或寡聚碳水化合物。

20、7、段落1所述的分离的益生菌被膜或被膜结构在配制配方食品中的应用。

21、8、一种预消化营养成分，其特征在于所述营养成分经由段落1所述的分离的益生菌被膜的预消化作用制备。

22、9、段落8所述的预消化营养成分，其特征在于所述预消化营养成分在配制预消化配方食品中的应用。

23、10、段落8所述的预消化营养成分，其特征在于所述预消化营养成分在配制医用配方食品中的应用。