一种杆菌霉素d的高效制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及生物发酵的技术领域，尤其涉及一种杆菌霉素d的高效制备方法及应用。
背景技术：
2.化肥和农药是提高作物产量和防治病虫害的主选产品，但同时产生了环境、能源以及成本等方面的问题，成为现在困扰世界各国的经济与社会发展的重大问题，严重制约着农业的可持续性发展。而利用来自微生物或真菌的蛋白质制备的生物制品(包括生物肥料和生物农药)是当代作物优质、高效和无公害生产的主要措施。近年来，国内外在此方面已开展了大量的科学研究。
3.农产品加工副产物如豆粕、花生粕、菜粕等有机氮源已被广泛应用于各种生物产品的发酵过程中，其中，豆粕及其衍生物是许多微生物次级代谢产物(如抗生素)工业发酵的最佳氮源。相对于豆粕，菜粕是一种更为廉价的蛋白资源，但其作为发酵原料直接生物利用报道相对较少，早期研究主要集中在以菜粕为基质固态发酵生产酶制剂的报道上。菜粕是一种非可溶性缓释氮源，大量的菜粕蛋白被非淀粉多糖如纤维素包裹，使得可溶性蛋白含量和游离氮的释放效率很低，将菜粕经过有效的预处理后，进行液态发酵生产有机酸和微生物油脂等高附加值产品。预处理工艺使得大量的游离氨基酸从固态菜粕中释放出来，不仅提高了微生物对菜粕中氮素营养的吸收利用效率，同时液拓宽了菜粕的微生物应用范围。但是预处理过程使菜粕利用过程中生产成本相应增加，还可能会造成菜粕中特点营养成分的破坏。
4.杆菌霉素d是芽孢杆菌经次级代谢产生的一种具有光谱抗真菌活性的环脂肽抗生素，其分子结构由七个氨基酸残基组成的肽链和一个β
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氨基脂肪酸侧链(链长c14-17不等)构成，因其独特的化学组成和两亲性的小分子肽结构，可广泛用于防治各种作物、蔬菜和瓜果的真菌病害，具有低抗药性、低毒、抗菌谱广、热稳定性高、生物可降解等优点，是一种极具研究开发价值和应用前景的新型生物农药。为了进一步提高杆菌霉素d的产量、降低生产成本，目前国内外大部分研究集中在菌种筛选、遗传改良、廉价物料的使用及培养基营养和环境因子的优化等方面。然而，目前的方法仍然存在发酵生产成本高、产量低，严重制约其工业化生产和商业化应用的缺陷。
技术实现要素：
5.本发明提供一种杆菌霉素d的高效制备方法及应用，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
6.本发明一方面提供一种杆菌霉素d的高效制备方法，该方法包括：
7.菌种活化：将冷冻保存的解淀粉芽孢杆菌以0.5％-1％的接种量接种到培养基中培养，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌；
8.摇瓶培养：活化后的解淀粉芽孢杆菌以0.5％-1％的接种量接种到培养基中进行
摇瓶培养；
9.发酵培养：将摇瓶培养的解淀粉芽孢杆菌在发酵培养基中进行发酵；所述发酵培养基包括：水、菜粕60-90g/l、碳源40-80g/l，缓冲溶液0.5-1.5g/l、镁离子无机盐0.3-0.7g/l以及锰离子无机盐 0.001-0.001g/l；
10.后处理：发酵后的固液混合物经振动筛过筛后，上清液中含杆菌霉素d粗品，下层沉淀为发酵后的菜粕残渣。
11.在一可实施方式中，所述碳源至少包括甘油、葡萄糖、糖蜜、淀粉中的一种。
12.在一可实施方式中，所述发酵培养基中的菜粕粉碎成60-100目后使用。
13.在一可实施方式中，所述摇瓶培养的解淀粉芽孢杆菌以2-10％的接种量接种到所述发酵培养基中。
14.在一可实施方式中，所述发酵培养的条件为：发酵温度26℃-30℃、 ph 6-8、发酵通风比1～2：1(vvm)、搅拌转速为300-800rpm、发酵时间64-72h。
15.在一可实施方式中，所述菌种活化中的培养条件为：培养温度 26-30℃、培养时间20-30h，搅拌转速180-250rpm。
16.在一可实施方式中，所述摇瓶培养中的培养条件为：培养温度 12-16℃、培养时间20-30h，搅拌转速180-250rpm。
17.在一可实施方式中，所述缓冲溶液中包括钾离子。
18.本发明另一方面提供一种杆菌霉素d在农用抗菌抑菌剂中的应用。
19.本发明至少具有以下有益效果：
20.1、本发明制备杆菌霉素d，发酵培养基中以廉价的菜粕作为氮源，不仅实现了低值菜粕的高值化利用，而且极大地降低了杆菌霉素d的生产成本；
21.2、菜粕是直接以一定比例添加到发酵培养基中，未对菜粕做任何预处理，因此避免了各种预处理操作对菜粕特定营养成分的损失，且操作简便，更易于工业化生产；
22.3、本发明还提供了一种农用抗菌抑菌剂，将上述制备方法制备得到的杆菌霉素d粗品溶液，可直接作为农用抗菌抑菌剂使用，对于农业领域的应用来说，具有低成本的效果。
具体实施方式
23.为使本发明的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.为了降低杆菌霉素d的生产成本，本发明提供一种杆菌霉素d的高效制备方法，该方法包括：
25.菌种活化：将-80℃冷冻保存的解淀粉芽孢杆菌以0.5％-1％的接种量接种到培养基中培养，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌；其中培养条件为：培养温度26-30℃、培养时间20-30h，搅拌转速180-250rpm；
26.摇瓶培养：活化后的解淀粉芽孢杆菌以0.5％-1％的接种量接种到培养基中进行摇瓶培养；其中培养条件为：培养温度26-30℃、培养时间 20-30h，搅拌转速180-250rpm；
27.发酵培养：将摇瓶培养的解淀粉芽孢杆菌在发酵培养基中进行发酵；所述发酵培养基包括：水、菜粕60-90g/l、碳源40-80g/l，缓冲溶液0.5-1.5g/l、镁离子无机盐0.3-0.7g/l以及锰离子无机盐 0.001-0.001g/l；其中发酵培养条件为：接种量2-10％、培养温度26-30℃、培养时间20-30h，搅拌转速180-250rpm。其中镁离子无机盐和锰离子无机盐可以为硫酸盐、氯化盐、硝酸盐等，本发明对此不做限制。
28.后处理：发酵后的固液混合物经振动筛过筛后，上清液中含杆菌霉素d粗品，下层沉淀为发酵后的菜粕残渣。
29.下面将结合具体实施例对本技术的杆菌霉素d的制备方法进行详细说明。
30.本发明所指的菜粕为油菜籽采用预压浸出工艺榨油的副产物。
31.实施例1
32.一种杆菌霉素d的高效制备方法，将产杆菌霉素d的解淀粉芽孢杆菌接入到以菜粕为氮源的培养基中，以质量分数为20％氢氧化钠、20％磷酸溶液调节培养基ph,液态发酵培养，分别收集发酵液和菜粕残渣，该方法包括如下步骤：
33.s11、菌种活化：先将-80℃冷冻保存的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb液体培养基中，培养温度为28℃、搅拌转速为200rpm、培养时间为24小时，得到活化的解淀粉芽孢杆菌。
34.s12、摇瓶培养：取活化的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb 液体培养基中进行摇瓶培养14小时，培养温度28℃，搅拌转速为 200rpm。
35.s13、发酵罐培养：将摇瓶培养的解淀粉芽孢杆菌在发酵培养基中 (5l发酵罐)进行发酵，发酵条件：接种量5％(v/v)，温度26-30℃， ph为6.5，发酵通风比为2：1(vvm)，搅拌转速600rpm，发酵72小时；本示例通过质量分数为20％氢氧化钠、20％磷酸溶液调节培养基ph至 6.5。
36.发酵培养基组成：菜粕90g/l，(菜粕经粉碎过80目筛)，葡萄糖 20g/l，k2hpo4·
3h2o 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，mnso4·
h2o 0.005g/l，水1l。
37.s14、分别收集发酵上清液和菜粕残渣：发酵后的固液混合物经100 目振动筛过筛处理后，上清液为含杆菌霉素d粗品，沉淀为发酵后的菜粕残渣。
38.杆菌霉素d含量测试：含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d的含量，所用条件：色谱柱为c18(2.1mm
×ꢀ
100mm)，检测波长为210nm，柱温30℃，所用流动相a为乙腈，流动相b为10mmol/l醋酸铵(v:v),流动相比例a:b＝35:65(v:v),流速 0.3ml/min，进样量5μl。
39.本实施例制备的含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d含量，杆菌霉素d产量为1.0g/l。
40.实施例2
41.一种杆菌霉素d的高效制备方法，将产杆菌霉素d的解淀粉芽孢杆菌接入到以菜粕为氮源的培养基中，以质量分数为20％氢氧化钠、20％磷酸溶液调节培养基ph,液态发酵培养，分别收集发酵液和菜粕残渣，该方法包括如下步骤：
42.s21、菌种活化：先将-80℃冷冻保存的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb液体培养基中，培养温度为26℃、搅拌转速为250rpm、培养时间为30小时，得到活化的解淀粉芽孢杆菌。
43.s22、摇瓶培养：取活化的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb 液体培养基中进行摇瓶培养14小时，培养温度为28℃，转速为200rpm。
44.s23、发酵罐培养：将摇瓶培养的解淀粉芽孢杆菌在发酵培养基中 (5l发酵罐)进行发酵，发酵条件：接种量5％(v/v)，温度26-30℃， ph7.2，发酵通风比为2：1(vvm)，搅拌转速600rpm，发酵72小时；本示例通过质量分数为20％氢氧化钠、20％磷酸溶液调节培养基ph至 7.2。
45.所述发酵培养基组成：菜粕60g/l，(菜粕经粉碎过100目筛)，葡萄糖20g/l,k2hpo4·
3h2o 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，mnso4·
h2o0.005g/l，水1l。
46.s24、分别收集发酵上清液和菜粕残渣：发酵后的固液混合物经100 目振动筛过筛处理后，上清液为含杆菌霉素d粗品，沉淀为发酵后的菜粕残渣。
47.杆菌霉素d含量测试：含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d的含量，所用条件：色谱柱为c18(2.1mm
×ꢀ
100mm)，检测波长为210nm，柱温30℃，所用流动相a为乙腈，流动相b为10mmol/l醋酸铵(v:v),流动相比例a:b＝35:65(v:v),流速 0.3ml/min，进样量5μl。
48.本实施例制备的含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d含量，杆菌霉素d产量为1.0g/l。
49.实施例3
50.一种杆菌霉素d的高效制备方法，将产杆菌霉素d的解淀粉芽孢杆菌接入到以菜粕为氮源的培养基中，以20％氢氧化钠、20％磷酸溶液调节培养基ph，液态发酵培养，分别收集发酵液和菜粕残渣，该方法包括如下步骤：
51.s31、菌种活化：先将-80℃冷冻保存的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb液体培养基中，培养温度28℃、搅拌转速200rpm、培养时间 24小时，得到活化的解淀粉芽孢杆菌。
52.s32、摇瓶培养：取活化的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb 液体培养基中进行摇瓶培养14小时，培养温度28℃，转速200rpm。
53.s33、发酵罐培养：将摇瓶培养的解淀粉芽孢杆菌在发酵培养基中 (5l发酵罐)进行发酵，发酵条件：接种量5％(v/v)，温度26-30℃， ph为8,发酵通风比为2：1(vvm)，搅拌转速600rpm，发酵72小时。
54.所述发酵培养基组成：菜粕60g/l，(菜粕经粉碎过80目筛)，甘油 40g/l，k2hpo4·
3h2o 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，mnso4·
h2o 0.005g/l，水1l。
55.s34、分别收集发酵上清液和菜粕残渣：发酵后的固液混合物经100 目振动筛过筛处理后，上清液为含杆菌霉素d粗品，沉淀为发酵后的菜粕残渣。
56.杆菌霉素d含量测试：含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d的含量，所用条件：色谱柱为c18(2.1mm
×ꢀ
100mm)，检测波长为210nm，柱温30℃，所用流动相a为乙腈，流动相b为10mmol/l醋酸铵(v:v),流动相比例a:b＝35:65(v:v),流速 0.3ml/min，进样量5μl。
57.本实施例制备的含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d含量，杆菌霉素d产量为0.9g/l。
58.实施例4
59.一种杆菌霉素d的高效制备方法，将产杆菌霉素d的解淀粉芽孢杆菌接入到以菜粕为氮源的培养基中，以20％氢氧化钠、20％磷酸溶液调节培养基ph，液态发酵培养，分别收集发酵液和菜粕残渣，该方法包括如下步骤：
60.s41、菌种活化：先将-80℃冷冻保存的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb液体培养基中，培养温度28℃、搅拌转速200rpm、培养时间为24小时，得到活化的解淀粉芽孢杆菌。
61.s42、摇瓶培养：取活化的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb 液体培养基中进行摇瓶培养14小时，培养温度28℃，转速200rpm。
62.s43、发酵罐培养：将摇瓶培养的解淀粉芽孢杆菌在发酵培养基中 (5l发酵罐)进行发酵，发酵条件：接种量5％(v/v)，温度26-30℃， ph为7.5，发酵通风比为2：1(vvm),搅拌转速600rpm，发酵72小时。
63.所述发酵培养基组成：菜粕90g/l，(菜粕经粉碎过80目筛)，葡萄糖20g/l，糖蜜60g/l,k2hpo4·
3h2o 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l， mnso4·
h2o 0.005g/l，水1l。
64.s44、分别收集发酵上清液和菜粕残渣：发酵后的固液混合物经100 目振动筛过筛处理后，上清液为含杆菌霉素d粗品，沉淀为发酵后的菜粕残渣。
65.杆菌霉素d含量测试：含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d的含量，所用条件：色谱柱为c18(2.1mm
×ꢀ
100mm)，检测波长为210nm，柱温30℃，所用流动相a为乙腈，流动相b为10mmol/l醋酸铵(v:v),流动相比例a:b＝35:65(v:v),流速 0.3ml/min，进样量5μl。
66.本实施例制备的含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d含量，杆菌霉素d产量为1.3g/l。
67.实施例5
68.一种杆菌霉素d的高效制备方法，将产杆菌霉素d的解淀粉芽孢杆菌接入到以菜粕为氮源的培养基中，以20％氢氧化钠、20％磷酸溶液调节培养基ph，液态发酵培养，分别收集发酵液和菜粕残渣，该方法包括如下步骤：
69.s51、菌种活化：先将-80℃冷冻保存的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb液体培养基中，培养温度28℃、搅拌转速180rpm、培养时间 30小时，得到活化的解淀粉芽孢杆菌。
70.s52、摇瓶培养：取活化的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb 液体培养基中进行摇瓶培养16小时，温度20℃，转速240rpm。
71.s53、发酵罐培养：将摇瓶培养的解淀粉芽孢杆菌在发酵培养基中 (5l发酵罐)进行发酵，发酵条件：接种量5％(v/v)，温度26-30℃， ph为7.5，发酵通风比为2：1(vvm),搅拌转速600rpm，发酵72小时。
72.所述发酵培养基组成：菜粕80g/l，(菜粕经粉碎过60目筛)，甘油 20g/l，葡萄糖20g/l，糖蜜40g/l、kh2po
4 1.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l， mnso4·
h2o 0.005g/l，水1l。
73.s54、分别收集发酵上清液和菜粕残渣：发酵后的固液混合物经100 目振动筛过筛处理后，上清液为含杆菌霉素d粗品，沉淀为发酵后的菜粕残渣。
74.杆菌霉素d含量测试：含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d的含量，所用条件：色谱柱为c18(2.1mm
×ꢀ
100mm)，检测波长为210nm，柱温30℃，所用
流动相a为乙腈，流动相b为10mmol/l醋酸铵(v:v),流动相比例a:b＝35:65(v:v),流速 0.3ml/min，进样量5μl。
75.本实施例制备的含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d含量，杆菌霉素d产量为1.1g/l。
76.上述实施例1-5制备得到的杆菌霉素d粗品溶液，可直接作为农用抗菌抑菌剂使用。
77.对照实施例
78.将产杆菌霉素d的解淀粉芽孢杆菌接入到以酵母粉为氮源的培养基中，该方法包括如下步骤：
79.s61、菌种活化：先将-80℃冷冻保存的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb液体培养基中，28℃、200rpm培养24小时，得到活化的解淀粉芽孢杆菌。
80.s62、摇瓶培养：取活化的解淀粉芽孢杆菌以1％接种量接种到lb 液体培养基中进行摇瓶培养14小时，温度28℃，转速200rpm。
81.s63、发酵罐培养：将摇瓶培养的解淀粉芽孢杆菌在发酵培养基中 (5l发酵罐)进行发酵，发酵条件：接种量5％(v/v)，温度26-30℃， ph6-8,发酵通风比为2：1(vvm),搅拌转速600rpm，发酵72小时。
82.所述发酵培养基组成：酵母粉30g/l，葡萄糖20g/l,k2hpo4
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3h2o1g/l，mgso4
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7h2o 0.5g/l，mnso4
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h2o 0.005g/l，水1l。
83.s64、分别收集发酵上清液和菜粕残渣：发酵后的固液混合物经100 目振动筛过筛处理后，上清液为含杆菌霉素d粗品，
84.杆菌霉素d含量测试：含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d的含量，所用条件：色谱柱为c18(2.1mm
×ꢀ
100mm)，检测波长为210nm，柱温30℃，所用流动相a为乙腈，流动相b为10mmol/l醋酸铵(v:v),流动相比例a:b＝35:65(v:v),流速 0.3ml/min，进样量5μl。
85.本实施例制备的含杆菌霉素d粗品经甲醇抽提后采用高效液相色谱检查杆菌霉素d含量，杆菌霉素d产量为0.6g/l。
86.通过实施例1-5与对照实施例的比较，实施例1-5采用本发明的技术方案，发酵培养基中以菜粕作为氮源，发酵72小时杆菌霉素d浓度高达1.3g/l，产量明显高于商业酵母粉或蛋白胨为氮源时的发酵水平，由于菜粕的成本较低，本发明一方面能够降低杆菌霉素d的生产成本，另一方面拓宽菜粕的应用范围。
87.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。以上结合具体实施例描述了本技术的基本原理，但是，需要指出的是，在本技术中提及的优点、优势、效果等仅是示例而非限制，不能认为这些优点、优势、效果等是本技术的各个实施例必须具备的。另外，上述公开的具体细节仅是为了示例的作用和便于理解的作用，而非限制，上述细节并不限制本技术为必须采用上述具体的细节来实现。
88.本技术中涉及的诸如“包括”、“包含”、“具有”等等的词语是开放性词汇，指“包括但不限于”，且可与其互换使用。这里所使用的词汇“或”和“和”指词汇“和/或”，且可与其互换使用，除非上下文明确指示不是如此。这里所使用的词汇“诸如”指词组“如但不限于”，且
可与其互换使用。
89.还需要指出的是，在本技术的方法中，各部件或各步骤是可以分解和/或重新组合的。这些分解和/或重新组合应视为本技术的等效方案。
90.提供所公开的方面的以上描述以使本领域的任何技术人员能够做出或者使用本技术。对这些方面的各种修改对于本领域技术人员而言是非常显而易见的，并且在此定义的一般原理可以应用于其他方面而不脱离本技术的范围。因此，本技术不意图被限制到在此示出的方面，而是按照与在此公开的原理和新颖的特征一致的最宽范围。
91.为了例示和描述的目的已经给出了以上描述。此外，此描述不意图将本技术的实施例限制到在此公开的形式。尽管以上已经讨论了多个示例方面和实施例，但是本领域技术人员将认识到其某些变型、修改、改变、添加和子组合。