一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用。


背景技术：

2.对硝基酚(p-np)是一类用途广泛的化工原料和药物中间体，主要用于生产合成医药、染料、有机磷农药及工业溶剂。其在自然环境中半衰期较长，对生态环境造成威胁，被认定为环境内分泌干扰物。
3.通用的化学分析方法能准确定量分析污染物中主要成分的含量，如高效液相色谱法(hplc)和新型快速检测法(新型纳米材料的传感器)。但现有方法不能直接并及时地反映各种有毒物质(如对硝基酚)在复杂环境介质中对生物的综合影响(即有毒物质的生物可利用性)。全细胞细菌生物传感器因其独特的生理特性，与现代光电检测手段完美匹配的特点而倍受关注。试纸以其检测成本低、操作简单等独特的特点在各个领域中应用广泛，例如：实验室所用的ph试纸、淀粉碘化钾试纸；工业所用的温度热敏试纸、废水检测试纸；生活所用的血糖试纸等。由于制作试纸的材料和方法不同，试纸的检测领域和检测灵敏度也不同。目前，尚未有研究利用全细胞生物传感器制备试纸条用来检测土壤中的对硝基酚。
4.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

5.鉴于尚未有研究利用全细胞生物传感器制备试纸条用于检测土壤中对硝基酚的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用，用以简便、快速、直观、准确地检测土壤中对硝基酚。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明的第一方面，提供一种用于检测对硝基酚的试纸条，其中，包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的e.coli bl21菌株，所述e.coli bl21菌株携带有ppnp-lacz质粒，所述ppnp-lacz质粒的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述ppnp-lacz质粒的物理图谱如图1所示。
8.可选地，所述用于检测对硝基酚的试纸条还包括设置在所述试纸基体上的β-半乳糖苷酶显色底物。
9.可选地，所述β-半乳糖苷酶显色底物选自5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷。
10.可选地，所述试纸基体为长方形，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有ppnp-lacz质粒的e.coli bl21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/8～1/2处。
11.可选地，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有ppnp-lacz质粒的e.coli bl21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/4处。
12.可选地，所述试纸基体选自滤纸。
13.本发明的第二方面，提供一种本发明如上所述的用于检测对硝基酚的试纸条的制备方法，其中，包括步骤：
14.利用引物聚合酶链反应，从ppnp-mrfp质粒上克隆ppnp基因片段的基因序列，从pcu19质粒上克隆lacz报告基因片段的基因序列，所述ppnp-mrfp质粒的核苷酸序列如seq id no：2所示；
15.将所述ppnp基因片段的基因序列和所述lacz报告基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到连接产物；
16.将所述连接产物转入到e.coli dh5α感受态细胞中，得到e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种；
17.将所述e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取ppnp-lacz质粒，通过质粒热击转化法，将提取的ppnp-lacz质粒导入到e.coli bl21菌株中，得到携带有ppnp-lacz质粒的e.coli bl21菌株，记作e.coli bl21/ppnp-lacz菌株；
18.将所述e.coli bl21/ppnp-lacz菌株接种于含有卡那霉素的液体培养基中，培养后收集，加入到含有乳糖和多粘菌素b的培养基中复苏；
19.将复苏后的菌株细胞悬液滴加在试纸基体上，在室温下风干后冷冻干燥，得到所述用于检测对硝基酚的试纸条。
20.可选地，扩增ppnp基因片段采用的引物：
21.正向引物序列：gagatccggctgctaacaaagc；
22.反向引物序列：atgtatatctccttgctattttctatttt；
23.扩增lacz报告基因片段采用的引物：
24.正向引物序列：aaaatagaaaatagcaaggagatatacatatgaccatgattacgccaa；
25.反向引物序列：gctttgttagcagccggatctcctatgcggcatcagagca。
26.可选地，将所述连接产物转入到e.coli dh5α感受态细胞中，得到e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种，利用引物聚合酶链反应鉴定所述e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种中的ppnp-lacz质粒；
27.所述鉴定采用的引物：
28.正向引物序列：gcaaatgggtcgcggatcc；
29.反向引物序列：gctttgttagcagccggatctc。
30.本发明的第三方面，提供一种本发明如上所述的用于检测对硝基酚的试纸条在检测土壤中可提取态对硝基酚中的应用。
31.有益效果：本发明用于检测对硝基酚的试纸条包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的e.coli bl21菌株，所述e.coli bl21菌株携带有ppnp-lacz质粒，当试纸条与含有对硝基酚的待检测液(如对硝基酚污染的土壤提取液)接触时，对硝基酚与ppnp-lacz质粒中的阻遏蛋白pobr的结合消除了pobr与操纵基因位点pobo的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因(lacz)，产生β-半乳糖苷酶，当向待检测液中加入β-半乳糖苷酶显色底物时，产生的β-半乳糖苷酶可降解β-半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，对硝基酚浓度不同产生的颜色强度不同，进而可检测待检测液中对硝基酚的浓度。本发明提供的试纸条便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用，用于检测对硝基酚时简便、快速、直观、准确。
附图说明
32.图1为本发明实施例中ppnp-lacz质粒的物理图谱。
33.图2为本发明实施例中试纸条用于检测对硝基酚时的原理示意图。
34.图3中(a)为本发明实施例1中对硝基酚对e.coli dh5α/ppnp-lacz菌株的诱导曲线，
35.(b)为本发明实施例1中对硝基酚对e.coli dh5α/ppnp-lacz菌株诱导后的菌落直观图，(c)为本发明实施例1中用于检测对硝基酚的试纸条的实物图。
36.图4中(a)为用实施例1中制备得到的试纸条检测不同浓度对硝基酚的显色图，(b)为不同土壤中对硝基酚浓度与试纸条显色颜色强度的关系图。
37.图5中(a)为用实施例1中制备得到的试纸条检测不同土壤样品中可提取态对硝基酚的显色图(b)为采用高效液相色谱和实施例1中制备得到的试纸条检测不同土壤样品中可提取态对硝基酚浓度的结果图。
38.图6为用实施例1中制备得到的试纸条检测土壤样品中可提取态对硝基酚的示意图。
具体实施方式
39.本发明提供一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
40.除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
41.本发明实施例提供一种用于检测对硝基酚的试纸条，其中，包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的e.coli bl21菌株，所述e.coli bl21菌株携带有ppnp-lacz质粒，所述ppnp-lacz质粒的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述ppnp-lacz质粒的物理图谱如图1所示。
42.本实施例中用于检测对硝基酚的试纸条包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的e.coli bl21菌株，所述e.coli bl21菌株携带有ppnp-lacz质粒，如图2所示，当试纸条与含有对硝基酚的待检测液接触时，对硝基酚与ppnp-lacz质粒中的阻遏蛋白pobr的结合消除了pobr与操纵基因位点pobo的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因(lacz)，产生β-半乳糖苷酶，当向待检测液中加入β-半乳糖苷酶显色底物时，产生的β-半乳糖苷酶可降解β-半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，对硝基酚浓度不同产生的颜色强度不同，进而可检测待检测液中对硝基酚的浓度。本发明提供的试纸条便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用，用于检测对硝基酚时简便、快速、直观、准确。
43.本发明实施例提供的试纸条在有效检测土壤中对硝基酚含量的同时并不引入任何有机化学试剂，为土壤中生物有效态对硝基酚的研究提供了有力手段。
44.在一种实施方式中，所述用于检测对硝基酚的试纸条还包括设置在所述试纸基体上的β-半乳糖苷酶显色底物。也就是说，为了采用试纸条检测含有对硝基酚的待检测液时更加方便，无需向待检测液中加入β-半乳糖苷酶显色底物，可将β-半乳糖苷酶显色底物直
接固定设置在所述试纸基体上。当试纸条与含有对硝基酚的待检测液接触时，对硝基酚与ppnp-lacz质粒中的阻遏蛋白pobr的结合消除了pobr与操纵基因位点pobo的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因(lacz)，产生的β-半乳糖苷酶可降解试纸条上固定设置的β-半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，进而实现对硝基酚的检测。具体地，可将携带有ppnp-lacz质粒的e.coli bl21菌株与β-半乳糖苷酶显色底物混合后设置在所述试纸基体上，也就是说携带有ppnp-lacz质粒的e.coli bl21菌株与β-半乳糖苷酶显色底物设置在试纸基体上的同一区域。
45.在一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶显色底物选自5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(x-gal)。当试纸条与含有对硝基酚的待检测液接触时，对硝基酚与ppnp-lacz质粒中的阻遏蛋白pobr的结合消除了pobr与操纵基因位点pobo的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因，产生的β-半乳糖苷酶可降解试纸条上固定设置的β-半乳糖苷酶显色底物而产生蓝色。
46.在一种实施方式中，所述试纸基体为长方形，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有ppnp-lacz质粒的e.coli bl21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/8～1/2处。当然，也可根据实际需要设置携带有ppnp-lacz质粒的e.coli bl21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷在所述试纸基体上的位置，也可根据实际需要选择试纸基体的形状。
47.在一种实施方式中，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有ppnp-lacz质粒的e.coli bl21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/4处。为了便于对对硝基酚的检测，将携带有ppnp-lacz质粒的e.coli bl21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷的混合物设置在所述试纸基体长度方向上的1/4处。
48.在一种实施方式中，所述试纸基体选自滤纸。本实施方式中，所述试纸基体可由市售的普通滤纸经过裁剪得到。作为举例，裁剪后得到的滤纸的尺寸可为4cm
×
1cm。
49.本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的用于检测对硝基酚的试纸条的制备方法，其中，包括步骤：
50.s11、利用引物聚合酶链反应(pcr)，从ppnp-mrfp质粒上克隆ppnp基因片段的基因序列，从pcu19质粒上克隆lacz报告基因片段的基因序列，所述ppnp-mrfp质粒的核苷酸序列如seq id no：2所示；
51.s12、将所述ppnp基因片段的基因序列和所述lacz报告基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到连接产物；
52.s13、将所述连接产物转入到e.coli dh5α感受态细胞中，得到e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种；
53.s14、将所述e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取ppnp-lacz质粒，通过质粒热击转化法，将提取的ppnp-lacz质粒导入到e.coli bl21菌株中，得到携带有ppnp-lacz质粒的e.coli bl21菌株，记作e.coli bl21/ppnp-lacz菌株；
54.s15、将所述e.coli bl21/ppnp-lacz菌株接种于含有卡那霉素的液体培养基中，培养后收集，加入到含有乳糖和多粘菌素b(pmb)的培养基中复苏；
55.s16、将复苏后的菌株细胞悬液滴加在试纸基体上，在室温下风干后冷冻干燥，得
到所述用于检测对硝基酚的试纸条。
56.步骤s11中，在一种实施方式中，利用引物聚合酶链反应(pcr)，从ppnp-mrfp质粒上克隆到ppnp基因片段(6747bp)的基因序列，退火温度为55℃。
57.扩增ppnp基因片段采用的引物：
58.正向引物序列：gagatccggctgctaacaaagc；
59.反向引物序列：atgtatatctccttgctattttctatttt。
60.在一种实施方式中，利用引物聚合酶链反应(pcr)从pcu19质粒上克隆lacz报告基因片段(375bp)的基因序列，退火温度为64℃，在设计引物时，添加同源片段。
61.扩增lacz报告基因片段采用的引物：
62.正向引物序列：aaaatagaaaatagcaaggagatatacatatgaccatgattacgccaa；
63.反向引物序列：gctttgttagcagccggatctcctatgcggcatcagagca。
64.作为举例，所述ppnp-mrfp质粒的制备方法如下：
65.s111、利用引物聚合酶链反应(pcr)，从pet22b-yfp质粒(其核苷酸序列如seq id no：3所示)上克隆到pet22b质粒骨架结构的ppnp基因片段(4677bp)的基因序列，退火温度为53℃；从pmv_pobro质粒(其核苷酸序列如seq id no：4所示)上克隆pobro-m报告基因片段(842bp)的基因序列，退火温度为60℃；从puc19_mrfp(其核苷酸序列如seq id no：5所示)质粒上克隆mrfp报告基因片段(860bp)的基因序列，退火温度为60℃；
66.扩增ppnp基因片段采用的引物：
67.正向引物序列(ppnpf)：gagatccggctgctaacaaagc；
68.反向引物序列(ppnpr)：ggatccgcgacccatttgc。
69.扩增pobro-m基因片段采用的引物：
70.正向引物序列(pobr-mf)：ttataccagattgcgcagttcgttg；
71.反向引物序列(pobr-mr)：
72.aaaccattttggatttgaatgttatgatggaacaacaccatcagtatttgg；
73.扩增mrfp基因片段采用的引物：
74.正向引物序列(mrfpf)：ccaaatactgatggtgttgttccatcataacattcaaatccaaaatggttt；
75.反向引物序列(mrfpr)：tcatttatataattcgtccatgccac。
76.s112、以pobro-m基因片段和mrfp基因片段的扩增产物的混合物(1:1，v/v)为模板，以pobr-mf/mrfpr引物，利用引物聚合酶链反应，得到pobro-m-mrfp基因；
77.采用的引物：
78.正向引物序列(pobr-mf)：ttataccagattgcgcagttcgttg；
79.反向引物序列为(mrfpr)：tcatttatataattcgtccatgccac；
80.s113、使用pclone007 blunt simple vector kit试剂盒将pobro-m-mrfp基因连接到pclone007骨架上，获得pclone007_pobro-m-mrfp质粒；
81.s114、从pclone007_pobro-m-mrfp质粒上克隆pobro-m-mrfp基因片段(1694bp)的基因序列，退火温度为64℃，设计引物时，添加同源片段；
82.扩增加同源臂pobro-m-mrfp基因片段采用的引物：
83.正向引物序列(pobr-mrfp-f)：ttataccagattgcgcagttcgttg；
84.反向引物序列(pobr-mrfp-r)：
85.gctttgttagcagccggatctctcatttatataattcgtccatgcc。
86.s115、将pobro-m-mrfp基因片段的基因序列和ppnp基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到ppnp-mrfp质粒。
87.步骤s12中，在一种实施方式中，将lacz报告基因片段和ppnp基因片段添加到pcr管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部，载体用10～100ng，载体与插入片段的摩尔比为1:1～1:10，各片段之固摩尔比为1:1，pmols＝(质量ng
×
1000)/(片段长度bp
×
650daltons)，混合液在50℃反应15min，得到连接产物。
88.步骤s13中，在一种实施方式中，所述将所述连接产物转入到e.coli dh5α感受态细胞中，得到e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种的步骤具体包括：
89.取100μl冰浴上融化的e.coli dh5α感受态细胞置于离心管中，加入所述连接产物，混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激30～45s，转移至冰浴中，静置2min，向离心管中加入500μl不含抗生素的无菌lb培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h，吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含50mg/l卡那霉素的lb培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
90.在一种实施方式中，将所述连接产物转入到e.coli dh5α感受态细胞中，得到e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种，利用引物聚合酶链反应鉴定所述e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种中的ppnp-lacz质粒；
91.所述鉴定采用的引物：
92.正向引物序列：gcaaatgggtcgcggatcc；
93.反向引物序列：gctttgttagcagccggatctc。
94.步骤s15中，所述培养的时间为4～5h。
95.所述加入到含有乳糖和多粘菌素b(pmb)的培养基中进行复苏的e.coli bl21/ppnp-lacz菌株与含有乳糖和多粘菌素b(pmb)的培养基的比例为：(3～4)mg：100μl。多粘菌素b作为对硝基酚的敏化剂。
96.本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的用于检测对硝基酚的试纸条在检测土壤中可提取态对硝基酚中的应用。
97.当试纸条用于检测土壤中可提取态对硝基酚时，对硝基酚与ppnp-lacz质粒中的阻遏蛋白pobr的结合消除了pobr与操纵基因位点pobo的结合，转录反方向的β-半乳糖苷酶基因，产生β-半乳糖苷酶，当向待检测液中加入β-半乳糖苷酶显色底物时，产生的β-半乳糖苷酶可降解β-半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，对硝基酚浓度不同产生的颜色强度不同，进而可检测待检测液中对硝基酚的浓度。本发明提供的试纸条便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用，用于检测对硝基酚时简便、快速、直观、准确。
98.下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
99.以下实施例所用菌种和质粒的信息如下表1所示。
[0100][0101]
实施例1
[0102]
(1)利用引物聚合酶链反应(pcr)，从ppnp-mrfp质粒上克隆到ppnp基因片段(6747bp)的基因序列，退火温度为55℃；
[0103]
扩增ppnp基因片段采用的引物：
[0104]
正向引物序列：gagatccggctgctaacaaagc；
[0105]
反向引物序列：atgtatatctccttgctattttctatttt；
[0106]
(2)利用引物聚合酶链反应(pcr)从pcu19质粒上克隆lacz报告基因片段(375bp)的基因序列，退火温度为64℃，在设计引物时，添加同源片段；
[0107]
扩增lacz报告基因片段采用的引物：
[0108]
正向引物序列：aaaatagaaaatagcaaggagatatacatatgaccatgattacgccaa；
[0109]
反向引物序列：gctttgttagcagccggatctcctatgcggcatcagagca；
[0110]
(3)将lacz报告基因片段的基因序列和ppnp基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，将lacz报告基因片段和ppnp基因片段添加到pcr管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部，载体用100ng，载体与插入片段的摩尔比为1:1，各片段之固摩尔比为1:1，pmols＝(质量ng
×
1000)/(片段长度bp
×
650daltons)，混合液在50℃反应15min，得到连接产物；
[0111]
(4)取100μl冰浴上融化的e.coli dh5α感受态细胞置于离心管中，加入上述连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激30s，迅速转移至冰浴中，静置2min，向离心管中加入500μl不含抗生素的无菌lb培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h，吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含50mg/l卡那霉素的lb培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；
[0112]
(5)在培养基上挑克隆菌斑，使用无菌的10μl移液枪头在含50mg/l卡那霉素的lb培养基和含50mg/l卡那霉素、20mg/l x-gal、10mg/l对硝基酚的lb固体培养基上分别画线，筛选可以在两个培养基上生长，并在含50mg/l卡那霉素、20mg/l x-gal、10mg/l对硝基酚的lb固体培养基上长出蓝色斑点的e.coli dh5α/ppnp-lacz菌株，使用引物pcr鉴定重组后的质粒ppnp-lacz，退火温度为60℃，验证质粒的核心片段为2436bp；
[0113]
鉴定采用的引物：
[0114]
正向引物序列：gcaaatgggtcgcggatcc；
[0115]
反向引物序列：gctttgttagcagccggatctc；
[0116]
并测序验证所得含重组质粒的e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种，ppnp-lacz质粒图谱如图1所示。
[0117]
使用不同浓度的对硝基酚(0、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000μg/l)对e.coli dh5α/ppnp-lacz菌种进行诱导12h，并测定od
420nm
值，获得诱导
bl21菌株，所述e.coli bl21菌株携带有ppnp-lacz质粒，当试纸条与含有对硝基酚的待检测液接触时，对硝基酚与ppnp-lacz质粒中的阻遏蛋白pobr的结合消除了pobr与操纵基因位点pobo的结合，转录反方向的β半乳糖苷酶基因，产生β-半乳糖苷酶，当向待检测液中加入β-半乳糖苷酶显色底物时，产生的β-半乳糖苷酶可降解β-半乳糖苷酶显色底物而产生颜色，对硝基酚浓度不同产生的颜色强度不同，进而可检测待检测液中对硝基酚的浓度。本发明提供的试纸条便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用，用于检测对硝基酚时简便、快速、直观、准确。本发明提供的试纸条在有效检测土壤中对硝基酚含量的同时并不引入任何有机化学试剂，为土壤中生物有效态对硝基酚的研究提供了有力手段。
[0129]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。