检测植物Pb

检测植物pb
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的dnazyme荧光传感器
技术领域
1.本发明属于生物检测传感器技术领域，具体涉及一种检测植物pb
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的dnazyme荧光传感器。


背景技术：

2.铅离子(pb
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)是一种威胁人类健康的普遍存在的污染物。当重金属铅被排放到土壤环境中，在土壤中生长的植物会吸收铅，从而影响植物健康；铅污染植物后，通过食物链进入人体，从而影响人体健康。当人食用了铅污染的植物，铅就会进入人体内影响人的健康。过量的铅会对人的肾脏、胃肠道、血液系统、心血管系统、生殖系统和神经系统造成伤害，容易造成肾衰竭、食欲不振、高血压、心脏病、抑郁症、贫血和骨质疏松等病症。
3.对于pb
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的检测方法，传统上主要依赖于一些复杂的分析检测技术，如原子吸收光谱(aas)，原子发射光谱(aes)，电感耦合等离子体质谱(icp-ms)，毛细管电泳(ce)、x射线荧光光谱(xfs)和伏安法等。尽管这些技术可以精确测定样品中的铅浓度，但目前主要用于实验室分析，且大部分的传统检测方法均受到一些限制。例如，icp-ms的方法检出限低，线性范围广，但是对检测技术人员要求较高，而设备运行成本也相当高。aas的铅检测方法获得的数据准确，但是需要的样品量较多，分析时间较长，而且样品制备处理步骤繁琐。xfs受组件性能的限制检出限较高，数据处理与校正数学模型多采用经验系数，适用范围不够广泛。伏安法的电化学铅检测方法受到准确度低、特异性低、检测范围窄的限制等等。这些限制使得这些方法用于现场检测的难度非常大。因此研发满足特异性高、灵敏便捷、样品制备简单的pb
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检测方法就显得非常迫切。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种检测植物pb
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的dnazyme荧光传感器。
5.一种检测植物pb
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的dnazyme荧光传感器，所述传感器是由四条碱基互补配对的dna链组成的dna四面体，其中一条链或者四条链上带有dnazyme，dnazyme链与带有单rna位点的底物链互补配对。
6.所述底物链的5’端设有荧光素基团，3’端设有或者不设有淬灭基团。
7.优选的，所述荧光素基团为alexa488基团。
8.所述带有dnazyme的dna链3’端设有淬灭基团。
9.所述四条碱基的核苷酸序列如序列表seq id no：1-4所示。
10.所述底物链的序列为：ggaatcactraggcactcagg。
11.所述dnazyme的核苷酸序列如序列表seq id no：5所示。
12.所述dna四面体与底物链摩尔比例为2:1，检测反应体系ph为6.5。
13.所述检测植物pb
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的dnazyme荧光传感器在检测植物提取物或植物体内pb
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浓度中的应用。
14.本发明的有益效果：本发明通过融合dnazyme和dna四面体纳米结构，开发了一系
列的pb
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荧光生物传感器，并证明了这些生物传感器对植物提取物中pb
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的检测能力。发明人在dna四面体的a探针上设计融合一条dnazyme链，在与dnazyme链互补配对的底物链中心设计了一个核糖核苷酸(ra)，在传感器与pb
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结合时底物链被“切割”，造成底物链断裂，释放出游离的标记有荧光基团的底物链，从而产生荧光信号。对该生物传感器进行了设计优化，通过将四条dnazyme融合到dna四面体中并使用量子产率显著高于fam的alexa488作为荧光基团，进一步提高了生物传感器的灵敏度，改进的生物传感器能够检测植物提取物中的pb
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。因此，本发明研发的pb
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生物传感器在通过快速检测植物体内pb
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水平来识别和跟踪污染区域方面具有巨大的潜力。本发明的传感器的最低检测限可达到4.24nm，灵敏度远高于一般的pb
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检测方法，改良后的pb
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生物传感器可以将土壤中生长的pb
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污染植物区分出来，简单的样品制备步骤也为在土壤生长的含pb
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植物中pb
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的检测提供快速简便的方法。本发明为为实现植物细胞内pb
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的原位检测奠定基础，由于dna四面体作为一种新兴的纳米材料，可以进入植物体内。本研究实现了将dna四面体和dnazyme组合的荧光传感器传递进入植物体细胞内。这也是首次将荧光标记的pb
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传感器在植物细胞内可视化，该方法为实现植物细胞内pb
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的原位检测提供了技术支撑。
附图说明
15.图1为pb
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生物传感器设计示意图；
16.图中，a，b为dnazyme结合到四面体dna纳米结构的a链上，在pb
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结合后，底物链在核糖核苷酸位点(ra)处被dnazyme切割，fam荧光基团被释放；pb-sub-1仅在其5'末端用fam进行了修饰，而pb sub-2在其5'和3'末端分别用fam和bhq1进行了修饰；c显示dnazyme和底物链的序列。
17.图2为dnazyme链与底物链的比例优化。
18.图3为反应体系ph的优化。
19.图4为v1生物传感器的pb
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梯度光谱图。生物传感器在0-1000nm pb
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的荧光光谱。
20.图5为v1生物传感器的pb
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梯度线性关系图，显示pb
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浓度和荧光信号之间相关性的图。
21.图6为v1传感器的金属离子特异性。
22.图7为优化后传感器的设计。
23.图8为pb
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生物传感器的优化前后比较。
24.图9为v3生物传感器的pb
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梯度光谱图。
25.图10为v3生物传感器的pb
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梯度线性关系图，显示pb
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浓度和荧光信号之间相关性的图。
26.图11为烟草提取物与反应体系的比例条件探索。
27.图12为烟草提取物与传感器的孵育时间条件探索。
28.图13为v3传感器检测在不同的含pb
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培养基上生长的烟草pb
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含量的荧光信号对比。图14为v3传感器检测在不同的含pb
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土壤上生长的烟草pb
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含量的荧光信号对比。
29.图15为不同pb
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含量的土壤上生长的烟草进行荧光共聚显微镜观察。
7.2-7.4)，使用bio-rad t100 pcr仪加热至95℃10min，然后冷却至4℃10min，组装成5μm的四面体100μl。
39.实施例2四面体与底物链的比例优化
40.在pb
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传感器中，底物链与dnazyme链之间形成分子间二倍体结构，底物链与dnazyme链之间的比例会对pb
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和dnazyme的反应产生影响，发明人对不同的四面体与底物链比值进行优化，用pbs组装合成5μm的四面体：a-enz，b，c，d组装成四面体，记为tsp1，用hepes溶液稀释pb-sub-2(fam)和pb(no3)2溶液至5μm，设置总体系为300μl。设置dna四面体tsp1的终浓度为0.3μm，pb-sub-2(fam)终浓度分别设置为0.05、0.1、0.15、0.2、0.3μm，即四面体与底物链的摩尔比分别为：6:1，3:1，2:1，1.5:1，1:1，pb
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实验浓度设为0和50nm，共设置五组(10个)处理，每个处理设置3个重复。五组试验处理除底物链添加量不同，其他条件完全相同。
41.将以上混合液置于37℃金属浴孵育2h。将孵育后的反应液吸取一定体积，置于比色皿中，在预热后的荧光光度计波长510nm到600nm处进行荧光波长测量。
42.试验结果表明，在dnazyme链与底物链的摩尔比为2:1时，获得最高信噪比，即四面体：底物链比例条件为2:1(图2)。
43.实施例3反应体系ph的优化
44.反应体系的ph对pb
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生物传感器也会造成一定的影响，而且由于最终目标是实现植物体的pb
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检测，植物体ph为6.0-7.5。因此需要对pb
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生物传感器反应体系ph进行条件优化。发明人通过对反应缓冲液hepes溶液的不同ph值设置来探索pb
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生物传感器的最佳工作条件，设置了6.0，6.5，7.0，7.5四组ph，信噪比f/f0为pb
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浓度为50μm的荧光值与pb
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浓度为0的荧光值的比值。
45.试验结果表明，在ph为6.5时，获得最高信噪比(图3)。因此，反应缓冲液ph值为6.5时拥有最高信号强度。
46.实施例4 v1生物传感器的pb
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梯度
47.在确定底物链的设计为pb-sub-2(fam)，dnazyme链：底物链比例条件为2:1，反应体系的ph设置为6.5的条件下，发明人对该v1传感器(四面体tsp1+pb-sub-2(fam))进行了pb
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梯度试验。将pb
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浓度范围设置为0到1000nm，将测试荧光范围设置为510-650nm。
48.试验结果表明，随着pb
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浓度的增加，荧光光谱显著上升，而且在大约520nm处有最大荧光值(图4)。接下来，发明人将520nm处的最大荧光值进行汇总处理。结果显示在0-50nm范围内，v1传感器的荧光信号与pb
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浓度呈良好的线性关系。在50-1000nm范围，随着pb
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浓度增加，荧光值增大，且逐渐呈现饱和状态(图5)。
49.实施例5金属离子特异性
50.为了研究v1传感器对pb
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的特异性，使用v1生物传感器检测其他二价金属离子，例如mg
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、cd
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、co
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、fe
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、cu
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和ca
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。信噪比f/f0为pb
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浓度为1μm的荧光值与pb
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浓度为0的荧光值的比值。
51.试验结果表明，该传感器在pb
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存在的情况下显示出显著的荧光增强，但在其他离子存在的情况下则没有明显荧光增强反应(图6)。这个研究结果表明基于荧光的pb
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生物传感器对pb
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具有高度特异性。
52.实施例6 pb
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生物传感器的优化
53.在进行了传感器的体外条件优化后，发明人对该传感器进行了设计方面的改良(如图7)。由原来一个dna四面体结合一个dnazyme优化为一个dna四面体结合四个dnazyme，且继续在这个基础上对底物链(pb-sub)进行优化，将底物链5’端的fam基团优化为alexa fluor 488。pb
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传感器的“底座”是由四条碱基互补配对的dna链组成的dna四面体，四条长链上各带有一个dnazyme，dnazyme链与带有单rna位点(ra)的底物链(pb-sub)互补配对。无pb
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存在时，底物链的fam/alex488荧光基团被底物链3'端和与其互补配对的dnazyme链3'端的bhq1淬灭，不发荧光。当pb
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存在时，底物链ra碱基位点被切割造成底物链断裂，5’端的fam/alex 488被激发荧光。
54.改良后的dna四面体序列如表2所示，a-enz、b-enz、c-enz、d-enz四条dna链上均携带dnazyme，四条链共同组成dna四面体。底物链为pb-sub-2(alex488)，与a-enz、b-enz、c-enz、d-enz四条链上的dnazyme部分互补配对。pb-sub-2(alex488)链5'端被alexa fluor488修饰，3'端被bhq1修饰。
55.表2优化后pb
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生物传感器的序列设计
[0056][0057]
实施例7优化前后生物传感器的比较
[0058]
在设计好优化后的四面体和底物链后，发明人需要对这几种组合的传感器进行体外实验比较。首先用pbs组装合成两种5μm的四面体：a-enz，b，c，d组装成的四面体命名为tsp1。a-enz，b-enz，c-enz，d-enz组装的四面体命名为tsp2。然后用hepes溶液稀释pb-sub-2(fam)和pb-sub-2(alex488)至5μm，配置50μm的pb(no3)2溶液。为了方便阐述，发明人把tsp1+pb-sub-2(fam)命名为v1，tsp2+pb-sub-2(fam)命名为v2，tsp2+pb-sub-2(alex488)命名为v3。发明人对这三种传感器进行了体外对比试验。根据之前优化的实验条件，设置反应体系终浓度：dna四面体0.3μm，底物链0.15μm，反应液ph为6.5，pb
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浓度为0和1μm，共设置三组(6个)处理，每个处理设置3个重复。6个试验处理除传感器的组合不同，其他条件完全相同。
[0059]
试验结果表明，v2传感器信噪比优于v1，表明有四条dnazyme链的四面体设计优于只有一条dnazyme链的四面体的设计(图8)。在优化了四面体的dnazyme链数量后，发明人对
pb
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的1/2ms培养基上培育本氏烟草。在先前优化条件即提取液/反应体系为1:30，孵育时间为1h的基础上，对两组烟草提取液进行荧光值测量。结果显示，在含pb
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培养基上生长的烟草制备的提取物中pb
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荧光信号显著高于对照(0mg/ml pb
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)培养基上生长的烟草制备的提取物(图13)，这表明v3生物传感器可以分辨出受pb
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污染的植物。结果表明，优化的v3生物传感器可以通过简单的样品制备有效地检测溶液和植物中的pb
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。
[0068]
在不同pb
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含量的土壤上生长的烟草荧光检测：为了观察土壤环境下，v3传感器的适用性，发明人对土培烟草进行了施加和不施加pb
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的处理，进而比对烟草提取液荧光信号。对施pb
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处理组，每天施加1ml 100μg/ml pb(no3)2母液，连续添加10天。除施pb
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外，其他管理方式相同。同样，在先前优化条件的基础上，对两组烟草进行荧光值测量。结果显示，在含pb
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培养基上生长的烟草制备的提取物中的pb
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荧光信号显著高于在对照(不含pb)培养基上生长的烟草制备的提取物(图14)。结果表明，v3 pb
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生物传感器可以将土壤上生长的pb
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污染植物区分出来，而简单的样品制备也为土壤生长的pb
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污染植物中pb
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检测提供了简便易行、高效快捷的方法。
[0069]
发明人对不同pb
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含量的土壤上生长的烟草进行荧光共聚显微镜观察。对不同处理的烟草叶片注射浓度为3μm的tsp2和2μm pb-sub-2(alex488)的传感器，避光环境下培养烟草1h后，在共聚焦显微镜下对不同处理的本氏烟草叶片进行荧光观察。发明人可以观察到，pb
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生物传感器可以进入植物细胞内，发明人将图片经过imagej的calibration bar分析，得出在pb
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处理土壤上生长的本氏烟草具有更强的荧光(图15)。
[0070]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。