卡拉胶酶在降解
κ-卡拉胶和红藻胶中的应用
技术领域
1.本发明涉及卡拉胶酶在降解κ-卡拉胶和红藻胶中的应用，属于功能酶技术领域。
背景技术：2.卡拉胶多糖是来源于红藻细胞壁的一种天然线性硫酸多糖，由d-半乳糖（d-gal）和3,6-脱水-d-半乳糖（d-ahg）组成的重复二糖亚基组成，分别通过β-1,4-和α-1,3-糖苷键交替连接。卡拉胶多糖根据硫酸盐基团的数量和种类，可被分为kappa（κ）-、iota（ι）-、lambda（λ）-卡拉胶。κ-卡拉胶仅含有d-半乳糖残基上的4号位硫酸基团（g4s），ι-卡拉胶则含有g4s和d-ahg残基上的2号位硫酸基团（da2s），而λ-卡拉胶除了含有g4s和da2s之外，在其d-ahg的6号位上含有一个硫酸基团（da6s）。特别地，自然界中还存在混合结构的卡拉胶多糖，例如红藻胶（furcellaran）的多糖链中含有κ-和β-（不含硫酸基团）两种不同结构的卡拉胶多糖。
3.卡拉胶多糖由于其生物难溶性和大分子性导致了其无明显生理活性，而低分子的卡拉胶寡糖则具备良好的生物可溶性且易被机体吸收利用，表现出良好的生理活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等活性，在食品和医药行业具有广泛的应用前景。因此，开发卡拉胶寡糖的高效特异性制备技术是实现卡拉胶高值化利用的关键。
4.目前制备卡拉胶寡糖的方法有物理法、化学法和生物法等，其中最常见的是基于酸解的化学法和基于酶解的生物法。通过化学法即酸解法制备奇数琼寡糖具有反应迅速、处理底物浓度较大等优点，但是经酸解之后产物较杂，分离较为困难。酶解法相比于酸解法具有反应温和、产物单一、易于分离等优点。因此酶法是一种绿色的具有可持续应用前景的方法，挖掘卡拉胶酶用以制备卡拉胶寡糖具有重要意义。
5.卡拉胶酶属于糖水解酶，通过断裂β-1,4-糖苷键将卡拉胶多糖降解为卡拉胶寡糖。根据底物专一性的不同，卡拉胶酶可分为κ-卡拉胶酶、ι-卡拉胶酶、λ-卡拉胶酶。卡拉胶酶的底物专一性强，例如κ-卡拉胶酶降解κ-卡拉胶时活性很高，但若用于降解ι-卡拉胶、λ-卡拉胶时，则活性很低甚至无降解活性。在cao siqi（2021）等关于卡拉胶酶cgbk16a_wf（属于糖苷水解酶16家族13亚族）的报道中揭示了它对于红藻胶的水解活性，但是进一步的结果显示它对于κ-卡拉胶无明显水解活性（front. microbiol. 12:697218）。现有技术中尚未发现了对两种或更多种底物均有较高降解活性的卡拉胶酶。
技术实现要素：6.针对上述现有技术，本发明经实验研究，发现了一种对两种卡拉胶都有高降解活性的卡拉胶酶，本发明将其命名为卡拉胶酶ouc-fagh16a，其对κ-卡拉胶和红藻胶均有极高的降解活性，底物专一性强，可以同时降解κ-卡拉胶和红藻胶，应用前景广阔。
7.本发明是通过以下技术方案实现的：卡拉胶酶在降解κ-卡拉胶和红藻胶中的应用，所述卡拉胶酶的氨基酸序列如下所示，如seq id no.1所示。
8.卡拉胶酶的氨基酸序列为：
mninkkivffgivfitlisctkskedevveiikteiiettpkeltplsdpnntggwvlnkeisdefdaavldetkwhiqgkggvyqsnfigrapsqfstdnvrlengmlkletrweptfnfstkidngvkyenittaaiigkkeftygymevkskaadcevtssfwatgsgvefdffemfgdhkqpsketagkerelwwsihdwssagsgrttyteyqdlgfrvaaafhvygfewsadgvkiyidgklfrdvsrtainsyddvlknnggngsnenfvitkpikiwfdqetfpwhgvpdtkeevgsngtidfeieylrvwhkk。
9.进一步地，所述降解κ-卡拉胶的条件为：κ-卡拉胶的浓度为0.01 g/ml，卡拉胶酶的加酶量为25 u/ml（1 u代表1分钟内释放1 μmol还原糖所需的酶量），温度为40℃，ph值为7.0，时间为24小时；所述降解红藻胶的条件为：红藻胶的浓度为0.01 g/ml，卡拉胶酶的加酶量为25 u/ml，温度为40℃，ph值为7.0，时间为24小时。
10.本发明通过实验研究发现，卡拉胶酶ouc-fagh16a并不是只对一种卡拉胶具有降解专一性，而是罕见地对两种卡拉胶（κ-卡拉胶和红藻胶）都有高的降解活性，降解κ-卡拉胶可得到聚合度为2、4、6、8的具有κ-结构的卡拉胶寡糖，降解红藻胶可得到聚合度为2、4的具有κ-结构和β-结构的卡拉胶寡糖；同时卡拉胶酶ouc-fagh16a不表现出对ι-卡拉胶和λ-卡拉胶的降解活性，这说明卡拉胶酶ouc-fagh16a是一种更为独特的卡拉胶酶，可以同时制备两种结构不同的卡拉胶寡糖，为研究卡拉胶寡糖的构效关系提供了有力工具，在降解卡拉胶、制备卡拉胶寡糖方面有着广阔的应用前景。本发明还构建了含卡拉胶酶基因的表达载体，实现了在大肠杆菌中的异源表达，为该酶的工业化大规模生产提供了良好的基础。卡拉胶酶ouc-fagh16a的最适反应温度为40℃，在该温度下作为底物的卡拉胶多糖可以保持溶液状态，可以更好地实现该酶的工业化应用。
11.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
12.图1：卡拉胶酶ouc-fagh16a纯化的sds-page电泳图，其中，m为标准蛋白marker，1道为粗酶。
13.图2：温度变化对卡拉胶水解酶活的影响示意图。
14.图3：卡拉胶酶ouc-fagh16a水解κ-卡拉胶和红藻胶的相对酶活比较图。
15.图4：卡拉胶酶ouc-fagh16a水解κ-卡拉胶的hplc图。
16.图5：卡拉胶酶ouc-fagh16a水解红藻胶的hplc-ms的hplc总离子图，其中，数字1～9为各离子峰编号。
17.图6：图5中编号为1的离子峰的ms图。
18.图7：图5中编号为2的离子峰的ms图。
19.图8：图5中编号为3的离子峰的ms图。
20.图9：图5中编号为4的离子峰的ms图。
21.图10：图5中编号为5的离子峰的ms图。
22.图11：图5中编号为6的离子峰的ms图。
23.图12：图5中编号为7的离子峰的ms图。
24.图13：图5中编号为8的离子峰的ms图。
25.图14：图5中编号为9的离子峰的ms图。
具体实施方式
26.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
27.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
28.实施例1编码卡拉胶酶ouc-fagh16a的基因的克隆本发明的编码卡拉胶酶ouc-fagh16a的基因克隆于海洋细菌居海藻黄杆菌（flavobacteriumalgicola）（也可人工合成该基因），该菌购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc1.12076，该菌分离自褐藻表面，表明其体内应该含有褐藻降解相关酶。于是对它进行了框架图测序，结果意外发现体内含有编码糖苷水解酶16家族13亚族（gh16_13）的卡拉胶酶ouc-fagh16a，序列号为wp_239867615.1。该基因包含有969个核苷酸，核苷酸序列如seqidno.2所示，编码的蛋白具有322个氨基酸，氨基酸序列如seqidno.1所示。目前尚未有研究者将该基因进行表达并研究其表达的蛋白的性质。
29.实施例2携带编码卡拉胶酶ouc-fagh16a的基因的重组表达载体的构建将扩增后的目的片段与线性化的pcold-sumo载体采用无缝拼接试剂盒在50℃反应5分钟，然后转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体抗性平板上。37℃培养箱培养12小时后挑取单克隆进行阳性克隆验证，将条带大小正确的单克隆送至测序公司测序，待测序比对完全正确，得到重组质粒，命名为pcolds-ouc-fagh16a，保存在-20℃冰箱，备用。
30.扩增所用引物如下：正向引物：5
’‑
gtaccctcgagggatccatgtgcactaaatccaaaga-3’，如seqidno.3所示。
31.反向引物：5
’‑
ggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaagctttttttatgccaaactcttaaatattc-3’，如seqidno.4所示。
32.实施例3含编码卡拉胶酶ouc-fagh16a的基因的重组工程菌的构建将实施例2中得到的携带编码卡拉胶酶ouc-fagh16a的基因的重组表达载体转化至大肠杆菌rtsbl21（de3）chaprone感受态细胞中，采用42℃热激转化法进行转化，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体抗性平板上。37℃培养箱培养12小时后挑取单克隆进行阳性克隆验证，将条带大小正确的单克隆于液体lb培养基（含100μg/ml氨苄青霉素）中培养12小时。保藏菌液于10%甘油中，于-80℃长期保存备用。
33.实施例4卡拉胶酶ouc-fagh16a的制备和纯化将实施例3中保存的菌液于lb液体培养基（含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素）中37℃培养12小时，然后转接至100mllb三角瓶（含100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml氯霉素和0.5mg/mll-阿拉伯糖）中，37℃、200rpm培养至od600为0.3，加入终浓度为2ng/ml的四环素（诱导chaprone伴侣蛋白表达），继续于37℃培养至od600为0.6，加入终浓度为0.1mmol/l的iptg，转至15℃培养16小时，表达卡拉胶酶ouc-fagh16a。
34.待发酵结束后，8000rpm离心5分钟收集菌体，加入无菌水洗涤菌体，再次8000rpm离心5分钟收集菌体。ph8.0的tris-hcl缓冲液复溶菌体后于冰浴条件下超声破碎（320
w，开3秒，停3秒持续破碎30分钟），破碎完全后8000rpm，4℃条件下离心15分钟，收集上清即为粗酶液。所表达的目的基因含有his纯化标签，因此采用ni-nta亲和层析进行纯化。采用不同浓度梯度（10、20、50、80、120、200和500mmol/l）咪唑进行目的蛋白的洗脱，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图1所示，结果显示200mmol/l咪唑可以得到较为单一的目的蛋白条带。将200mmol/l咪唑洗脱液用50kda超滤管置换浓缩，采用超纯水为置换溶剂，再浓缩至蛋白浓度为2g/l的酶液，冻干，得到纯酶（粉末状），用于酶学特性的测定。
35.实施例5测定卡拉胶酶ouc-fagh16a的最适反应条件实施例4中得到的卡拉胶酶ouc-fagh16a纯酶，选用红藻胶为底物测定卡拉胶酶ouc-fagh16a的最适反应温度：在不同温度（30、35、40、45、50和60℃）条件下测定温度对其水解酶活的影响，反应底物为浓度为0.01g/ml的红藻胶溶液，反应体系总体积为200μl，酶添加量为0.06mg，ph值为7.0，反应30分钟后终止反应。反应释放的还原糖采用dns法进行测定，即反应液200μl，终止反应后加入300μldns后煮沸5分钟显色，冷却至室温后取200μl于540nm处测定吸光值，根据标准曲线（此处以d-半乳糖为标准物质绘制标准曲线）计算还原糖的产生量。根据测定结果，可知卡拉胶酶ouc-fagh16a在40℃温度条件下显示出最大的水解活力，如图2所示。
36.然后，在温度40℃、ph值7.0、反应时间30分钟条件下测定卡拉胶酶对不同反应底物的酶活，反应底物分别为0.01g/ml的红藻胶溶液、0.01g/ml的κ-卡拉胶溶液，结果为：水解红藻胶的酶活为34u/mg，水解κ-卡拉胶的酶活为15u/mg，说明卡拉胶酶水解红藻胶的相对酶活更高，约为水解κ-卡拉胶酶活的2.2倍，如图3所示。
37.实施例6测定卡拉胶酶ouc-fagh16a水解κ-卡拉胶的水解产物将实施例4中得到的卡拉胶酶ouc-fagh16a纯酶与浓度为0.01g/ml的κ-卡拉胶溶液（反应体系总体积为200μl，酶添加量为5u）在40℃，ph7.0条件下反应24小时后采用hplc测定其水解产物。如图4所示，水解产物主要由二糖、四糖、六糖和八糖组成。
38.实施例7测定卡拉胶酶ouc-fagh16a水解红藻胶的水解产物将实施例4中得到的卡拉胶酶ouc-fagh16a纯酶与浓度为0.01g/ml的红藻胶溶液（反应体系总体积为200μl，酶添加量为5u）在40℃，ph7.0条件下反应24小时后采用hplc-ms测定其水解产物。如图5所示，水解产物中含有二糖、四糖、六糖、八糖、十糖和十二糖，其中的主要成分为四糖和六糖，具体的ms结果如图6～图14所示，主要成分的四糖和六糖均是相应的具有κ-结构的卡拉胶寡糖脱除一个硫酸基团后的寡糖，说明其中含有一个新的具有β-结构的卡拉胶二糖单元。
39.实施例8测定卡拉胶酶ouc-fagh16a水解ι-卡拉胶的水解活性将实施例4中得到的卡拉胶酶ouc-fagh16a纯酶与浓度为0.01g/ml的ι-卡拉胶溶液（反应体系总体积为200μl，酶添加量为2u）在40℃，ph7.0条件下反应30分钟后测定还原糖的生成，结果表明无还原糖生成，说明卡拉胶酶ouc-fagh16a对于ι-卡拉胶无水解活性。
40.实施例9测定卡拉胶酶ouc-fagh16a水解λ-卡拉胶的水解活性将实施例4中得到的卡拉胶酶ouc-fagh16a纯酶与浓度为0.01g/ml的λ-卡拉胶溶液（反应体系总体积为200μl，酶添加量为2u）在40℃，ph7.0条件下反应30分钟后测定还原糖的生成，结果表明无还原糖生成，说明卡拉胶酶ouc-fagh16a对于λ-卡拉胶无水解活性。
41.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将
在所附权利要求的范围内。