一种高温度稳定性的突变壳聚糖酶

1.本发明涉及基因克隆，定点突变，基因重组技术，具体表述为一种高温度稳定性的突变壳聚糖酶。


背景技术：

2.壳聚糖是由氨基葡萄糖(glcn)通过β-1,4-糖苷键相连接的多糖。壳聚糖是几丁质经脱乙酰化的产物，广泛存在于低等植物真菌、藻类细胞、贝类、软体动物(如鲑鱼、鱿鱼)的外壳和软骨中，是地球上仅次于纤维素的第二大天然高分子化合物，是可再生生物资源。
3.有研究报道表明，壳聚糖功能优越，具有抗菌、抗肿瘤、提高免疫力等优良的生物学活性，因此，它在食品、医药、农业和化妆品等领域有广泛的应用前景。然而，有研究报道指出，壳聚糖的许多功能特性只有在被降解到一定程度时才会表现出来，它降解产物多为壳寡糖，壳寡糖不仅具有壳聚糖的所有性能，而且壳寡糖易溶于水,具有吸湿性和保湿性，能很好地应用于食品、医药、农业和化妆品业。
4.生产壳寡糖的方法主要有三种：物理法，化学法，酶水解法。出于产品的安全性、降解效率、环境保护的角度考虑，工业化通常采用酶解法降解壳聚糖。并且，酶水解法由于专一性强，反应条件温和，易于制备，已成为近年来的研究热点。
5.壳聚糖酶是专门用以降解壳聚糖为壳寡糖的一种水解酶，根据碳水化合物活性酶数据库(www.cazy.org)可知，壳聚糖酶被归类为糖苷水解酶(gh)家族46，75，80和8。gh46、gh75和gh80目前只含有壳聚糖酶，而gh8家族含有其他一些糖苷水解酶。据了解，真菌来源的壳聚糖酶主要分布在gh75家族中，而细菌来源的壳聚糖酶主要属于gh46家族，少数属于gh80。阿维链霉菌是一种革兰氏阳性丝状细菌，是阿维菌素和伊维菌素的主要生产菌株。heggset曾报道过阿维链霉菌gh75家族的一种壳聚糖酶，主要产dp≥2的壳寡糖。然而，目前还没有关于阿维链霉菌gh46家族壳聚糖酶酶分子改造的报道较少，本研究前期利用pcr技术克隆了一种新的壳聚糖酶sacsn46a，经研究发现该酶具有广泛的底物谱，但是温度稳定性有待提高。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，通过对壳聚糖酶sacsn46a进行分子改造，提供一种高温度稳定性的突变壳聚糖酶，使酶解法更好地应用于工业生产壳寡糖中。
7.为了实现本发明目的，所采用的技术方案为：
8.一种高温度稳定性的突变壳聚糖酶，为壳聚糖酶sacsn46a的氨基酸序列第237位甘氨酸突变为丙氨酸(g237a)而得，壳聚糖酶sacsn46a的氨基酸序列为seq no:1，突变壳聚糖酶的氨基酸序列为seq id no:3。
9.具体的，本发明利用popmusic软件筛选出可能对sacsn46a温度稳定性有影响的位点，选取其中1个位点进行突变，并在大肠杆菌rosetta(de3)中进行了功能表达。对其生化性质的研究表明，突变酶的温度稳定性相比原始酶提高。
10.本发明提供了一种定点突变改造的突变重组壳聚糖酶，并在大肠杆菌rosetta中表达。所述发生突变的氨基酸位点为将壳聚糖酶(sacsn46a)第237位甘氨酸突变为丙氨酸(g237a)。
11.本发明突变体方法步骤如下：
12.1.设计两条引物，扩增壳聚糖酶sacsn46a基因，去除信号肽，壳聚糖酶sacsn46a的基因序列为seq no.2，将扩增的目的基因克隆到表达载体pet-28a中，构建重组质粒pet-sacsn46a；
13.两条引物为：上游引物cgggatccgcacccgtcggcctggacgac，下游引物cccaagctttcagccgatgtggtagctgtc。
14.2.利用swiss-model在线软件对壳聚糖酶sacsn46a进行模拟，获得壳聚糖酶(sacsn46a)的空间结构。
15.3.将步骤2的sacsn46a的空间结构提交至popmusic预测软件，利用popmusic预测软件计算sacsn46a每个突变氨基酸的去折叠自由能变化，确定与sacsn46a稳定性相关的关键氨基酸位点，并将其作为突变位点。
16.4.设计定点突变引物，上游引物cgggatccgcacccgtcggcctggacgac，下游引物cccaagctttcaggcgatgtggtagctgtc。通过pcr技术得到突变壳聚糖酶基因，将扩增的目的基因克隆到表达载体pet-28a中，构建重组质粒pet-g237a，该壳聚糖酶的核苷酸序列为seq no.4。
17.5.将步骤4的重组载体转入大肠杆菌rosetta(de3)进行诱导培养，离心后收集菌体，经超声破碎细胞后，使用ni-nta亲和层析柱进行蛋白纯化获得温度稳定性提高的突变壳聚糖酶。
18.与现有技术相比，本发明取得了如下技术优势：本发明使用的壳聚糖酶sacsn46a具有较广的底物谱，提供的突变体温度稳定性显著提升，且在提高温度稳定性的同时并没有对该酶的其他特性造成影响。在适宜条件下突变壳聚糖酶仍能将壳聚糖水解为glcn和(glcn)2，说明本发明所述的突变壳聚糖酶在工业化生产中具有良好的应用前景。
附图说明
19.图1为本发明实施例中的野生型壳聚糖酶及其突变体的温度稳定性。
具体实施方式
20.本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
21.本发明下面结合实施例作进一步详述：
22.1.壳聚糖酶突变位点的确认
23.利用swiss-model以链霉菌n174(streptomyces sp.n174)壳聚糖酶(1chk_a)为模板对壳聚糖酶sacsn46a进行蛋白三维结构模拟，获得壳聚糖酶sacsn46a的空间结构，利用popmusic预测软件计算sacsn46a每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(δδg)，来辅助设
计提高其稳定性，确定与sacsn46a稳定性相关的关键氨基酸位点，由于壳聚糖酶第237位氨基酸的去折叠自由能变化相对较大，因此通过设计并人工合成上、下游引物进行pcr获得相应的突变基因。
24.壳聚糖酶sacsn46a的基因序列如seq no.2所示。
25.上游引物氨基酸序列为cgggatccgcacccgtcggcctggacgac，下游引物氨基酸序列为cccaagctttcagccgatgtggtagctgtc。
26.酶切位点为bamhⅰ和hindⅲ。
27.pcr体系：
[0028][0029][0030]
模板为pet-sacsn46a。
[0031]
pcr扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，64℃退火1min，68℃延伸10min，15个循环，4℃保温。
[0032]
2.dpni消化模板质粒
[0033]
取20μlpcr产物，在pcr产物中直接添加1μldpni限制性内切酶。
[0034]
3.转入大肠杆菌
[0035]
取10μl酶切产物直接转化e.coli dh5α感受态细胞。将携带突变质粒的重组细胞送至上海生物工程有限公司测序。将测序正确的突变质粒转化至e.coli bl21。
[0036]
4.蛋白纯化
[0037]
将超声破碎细胞获得的粗酶液上样至ni-nta亲和层析柱，用0.02m咪唑洗脱液(0.02m tris-hcl，ph 8.0，0.5m nacl，0.02m咪唑和10％甘油)洗脱后，再使用0.08m咪唑洗脱液(0.02m tris-hcl，ph 8.0，0.5m nacl，0.08m咪唑和10％甘油)进行洗脱，收集含有壳聚糖酶活性的洗脱液，通过透析除去咪唑，获得突变壳聚糖酶(突变体g237a)，突变壳聚糖酶保存在-20℃。
[0038]
5.酶学性质检测
[0039]
使用dns法测定酶活，在2ml的反应体系中加入1475μl ph缓冲液、500μl胶体壳聚糖溶液，加入25μl步骤4获得的突变壳聚糖酶充分混匀酶液，立即在40℃水浴锅中反应
10min，取出，加入1.5ml dns溶液终止反应，再用沸水煮5min，最后使用蒸馏水定容至25ml，冷却至室温后，混匀，转入50ml离心管中，设定8000rpm离心5min，取上清测定其在520nm下的od值，将加入25μlddh2o的溶液设为空白对照组调零。
[0040]
酶活定义：在40℃条件下，1分钟内催化生产相当于1μmol氨基葡萄糖的还原糖所需要的酶量为1个酶活单位(u)。
[0041]
(1)最适ph
[0042]
在40℃的温度条件下，在不同的ph缓冲液(ph 3.0-8.0)中，测定壳聚糖酶的酶活。以酶活最高点作为100％。
[0043]
(2)ph稳定性
[0044]
在0℃的条件下，将壳聚糖酶置于ph 6.4的磷酸盐缓冲液中保存2h，最开始测定的壳聚糖酶酶活作为100％。
[0045]
(3)最适温度
[0046]
在最适ph条件下，将反应体系分别置于25-80℃下进行反应，每5℃为一个温度梯度，测定壳聚糖酶的酶活。以酶活最高点作为100％。
[0047]
(4)温度稳定性
[0048]
将壳聚糖酶置于60℃、ph 6.4条件下保存2h，最开始时测定的壳聚糖酶酶活作为100％。
[0049]
6.野生型壳聚糖酶(本发明中野生型壳聚糖酶即为壳聚糖酶sacsn46a)及其突变体的酶学性质
[0050]
野生型壳聚糖酶及其突变体的酶学性质如图1和表1，突变体g237a温度稳定性明显高于野生型(提高4.8倍)，但是比酶活有所下降。
[0051]
表1野生型壳聚糖酶及其突变体的酶学性质
[0052][0053]
本发明突变壳聚糖酶的酶切方式，其特征表现为内切型，能水解由β-1,4-糖苷键连接的多种多糖，但不能水解由α-1,4-糖苷键连接的多糖。突变壳聚糖酶的水解产物为氨基葡萄糖glcn和壳二糖(glcn)2。
[0054]
seq no.1
[0055]
s.avermitilis壳聚糖酶蛋白序列
[0056]
apvglddpakkeiamklvssaenssldwkaqykyiedigdgrgytagiigfcsgtgdmldlvelytqrkpgnvlatylpalrnvnggdshqgldpgfpgdwrraaqdsafqqaqnderdrvyfdpavrqgkadgigvlgqftyydaivmhgdggdstsfssirgralakaeppaqggnevtylnafldarvwamrqeeahsdtsrvdtaqrvfltkgnlnldppldwkvygdsyhig
[0057]
seq no.2
[0058]
s.avermitilis壳聚糖酶基因序列
[0059]
gcacccgt cggcctggac gacccggcga agaaagagat cgccatgaag ctcgtgtcca gcgcggagaa ctcctcgctggactggaagg cccagtacaa gtacatcgag gacatcggcg acggccgcgg ctacaccgccgggatcatcg gcttctgctc cggcaccggc gacatgctcg acctcgtcga gctctacacc cagcgcaagc cggggaacgt cctggccacg tatctgcccg ccctgcgcaa cgtcaacggcggcgactcgc accagggcct ggacccgggc ttccccggcg actggcgccg cgcggcccag gactcggcgt tccagcaggc ccagaacgac gaacgcgacc gcgtctactt cgacccggcc gtccggcagg ggaaggcgga cggtatcggc gtactcggac agttcacgta ctacgacgccatcgtcatgc acggggacgg cggtgacagc accagcttca gcagcatccg cgggcgcgccctggccaagg ccgagccgcc ggcgcagggc ggcaacgagg tgacgtacct gaacgccttcctcgacgccc gggtctgggc gatgcggcag gaggaggccc actcggacac cagccgggtc gacaccgccc agcgggtctt cctgacgaag ggcaacctga acctggatcc gccactggac tggaaggtgt acggggacag ctaccacatc ggctga
[0060]
seq id no.3
[0061]
壳聚糖酶突变体氨基酸序列
[0062]
apvglddpakkeiamklvssaenssldwkaqykyiedigdgrgytagiigfcsgtgdmldlvelytqrkpgnvlatylpalrnvnggdshqgldpgfpgdwrraaqdsafqqaqnderdrvyfdpavrqgkadgigvlgqftyydaivmhgdggdstsfssirgralakaeppaqggnevtylnafldarvwamrqeeahsdtsrvdtaqrvfltkgnlnldppldwkvygdsyhia
[0063]
seq no.4
[0064]
壳聚糖酶突变体基因序列
[0065]
gcacccgt cggcctggac gacccggcga agaaagagat cgccatgaag ctcgtgtcca gcgcggagaa ctcctcgctggactggaagg cccagtacaa gtacatcgag gacatcggcg acggccgcgg ctacaccgccgggatcatcg gcttctgctc cggcaccggc gacatgctcg acctcgtcga gctctacacc cagcgcaagc cggggaacgt cctggccacg tatctgcccg ccctgcgcaa cgtcaacggcggcgactcgc accagggcct ggacccgggc ttccccggcg actggcgccg cgcggcccag gactcggcgt tccagcaggc ccagaacgac gaacgcgacc gcgtctactt cgacccggcc gtccggcagg ggaaggcgga cggtatcggc gtactcggac agttcacgta ctacgacgccatcgtcatgc acggggacgg cggtgacagc accagcttca gcagcatccg cgggcgcgccctggccaagg ccgagccgcc ggcgcagggc ggcaacgagg tgacgtacct gaacgccttcctcgacgccc gggtctgggc gatgcggcag gaggaggccc actcggacac cagccgggtc gacaccgccc agcgggtctt cctgacgaag ggcaacctga acctggatcc gccactggac tggaaggtgt acggggacag ctaccacatc gcctga
[0066]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。