一种高产L-乳酸的鼠李糖乳杆菌基因工程菌的构建方法

一种高产l-乳酸的鼠李糖乳杆菌基因工程菌的构建方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程分子改造技术领域，尤其涉及一种高产l-乳酸的鼠李糖乳杆菌基因工程菌的构建方法。


背景技术：

2.乳酸是一种多用途的天然有机酸，l-乳酸经聚合生成的聚l-乳酸(poly lactic acid，pla)具有生物相容性、可降解性以及无毒害作用等优良性能，是非常理想的高分子材料，可实现生态循环使用，具有广阔的工业应用前景。
3.用于乳酸生产的鼠李糖乳杆菌是同型乳酸发酵，适合工业应用开发。其基因组中存在l-乳酸脱氢酶和d-乳酸脱氢酶的编码基因，乳酸发酵产物中混合了l-乳酸和d-乳酸的异构体，生产过程后期的产物分离和纯化成本较高。对其菌株改造包括物理、化学诱变和基因工程分子改造等手段。由于鼠李糖乳杆菌是格兰氏阳性菌，细胞壁致密，大部分菌株缺少精细的基因组结构信息，早期对其进行的基因改造存在较大的难度，因此大部分的生产菌株是通过自然筛选和人工诱变获得，然而这些乳酸生产菌株在发酵过程中依然存在乳酸光学纯度不高，产率低的问题。近年来，得益于基因组学、代谢组学的快速发展，通过基于全基因组分析的精确定向基因编辑技术对鼠李糖乳杆菌进行基因改造，改变了过去只能以少数几个已知的分类学上亲缘关系相近的种属菌株的相关基因序列为参考的状况，很大程度上提高了工程菌的改造效率，可以赋予菌株更多、更合适的工业生产特性。目前乳酸菌基因改造中常用的基因编辑方法是基于质粒的同源重组、red/recet介导的dna重组和crispr基因编辑等。天然的乳杆菌是国际公认的食品安全生产菌株，上述基因改造方法大都会给出发菌株导入外源基因或dna片段，形成潜在的安全风险，影响工程菌株的安全评估和生产应用。目前对乳酸菌乳酸表达的基因工程改造基本集中在对其乳酸脱氢酶基因(ldhd、ldhl)的操作上，或基因敲除，或基因沉默或增加基因拷贝数。
4.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)，主要产生于糖酵解和柠檬酸循环，用于胞内大多数氧化还原反应，是微生物生命代谢活动中必不可少的辅因子；rex，nadh相关的转录因子，对细胞内氧化还原电位作出反应，并对参与革兰氏阳性细菌能量代谢和发酵生长的基因的表达进行负性控制；rex的dna结合活性受细胞内nadh/nad
+
比率的调节，在较低的nadh：nad
+
比值下，rex蛋白与靶位点结合，抑制参与nadh再氧化的基因转录，而nadh浓度的升高导致rex与dna的解离和靶基因的转录阻遏解除。目前国内外对rex的研究主要集中在它的结构，nadh结合rex的构型变化，rex的dna结合位点的保守性的研究，尚无乳酸菌中rex基因与l-乳酸相关性的研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种高产l-乳酸的鼠李糖乳杆菌基因工程菌的构建方法，解决提高鼠李糖乳杆菌发酵生产l-乳酸的光学纯度和发酵产率的技术问题。
6.本发明以出发菌株的全基因组序列信息为参考，采用非复制型质粒pk18mobsacb
设计鼠李糖乳杆菌rex基因的敲除方法，构建了鼠李糖乳杆菌rex基因缺失工程菌株，提高了菌株l-乳酸的表达产量。另外，利用该方法构建的同源双交换基因工程菌株没有外源基因的导入，适宜于食品安全乳酸菌的高性能遗传改造。
7.本发明采用1株经过基因工程改造的鼠李糖乳杆菌l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl
为出发菌株，以在发酵生长中起核心作用的调节能量代谢和响应氧化还原电位的dna转录抑制因子为目标进行编辑，通过质粒介导的同源交换策略，构建1株高产高光学纯l-乳酸的鼠李糖乳杆菌基因工程菌株。
8.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
9.一种高产l-乳酸的鼠李糖乳杆菌基因工程菌的构建方法，所述方法包括如下步骤：
10.步骤1：分析l.rhamnosusatcc 11443全基因组序列，筛选出rex基因；
11.步骤2：根据l.rhamnosusatcc 11443的rex基因序列，设计引物rex-up-f、rex-up-r、rex-down-f、rex-down-r，用引物rex-up-f/rex-up-r，rex-down-f/rex-down-r分别pcr扩增rex基因上游up-rex、down-rex片段各约1 000bp；
12.步骤3：通过overlap pcr将up-rex和down-rex片段进行拼接，得到dna片段δrex为1 800-2 000bp，将δrex片段t-a克隆至pmd20-t载体，电转化大肠杆菌e.coli dh5α，蓝白筛选，得到中间质粒pmd20-δrex，以及携带中间质粒的菌株e.coli dh5α-pmd20-δrex；
13.步骤4：获取ecor i和sph i双酶切中间质粒pmd20-δrex和自杀质粒pk18mobsacb，将酶切的δrex和pk18mobsacb片段进行连接，并电转化e.coli dh5α，蓝白筛选，得到敲除质粒pk18mobsacb-δrex，以及携带敲除质粒的菌株e.coli dh5α-pk18mobsacb-δrex，pk18mobsacb-δrex用于构建rex基因缺失菌株；
14.步骤5：取-80℃保存的l.rhamnosusatcc 11443-δldhd
ldhl
甘油菌种涂布接种至培养基中若干次培养得到l.rhamnosusatcc 11443-δldhd
ldhl
的电转化感受态细胞，按每管80μl分装于1.5ml离心管中，-80℃冻存；
15.步骤6：取0.5～1.0μg敲除质粒pk18mobsacb-δrex与80μl l.rhamnosusatcc 11443-δldhd
ldhl
电转化感受态细胞充分混合均匀，转移至冰上预冷的2mm电极杯中，进行电转化，电转化后快速加入预冷的不含吐温80的mrs复苏液1ml，混匀，转移至1.5ml离心管中，冰浴5～8min，然后32℃培养2～3h，得到复苏培养菌，取适量复苏培养菌液涂布含卡那霉素的mrs固体培养基平板，37℃培养48h，得到转化子；
16.步骤7：将转化子单菌落分别对应点菌接种至含有卡那霉素的mrs固体培养基平板和含有卡那霉素、蔗糖的mrs固体培养基2种平板，筛选同源单交换的阳性克隆菌株，将筛选得到的单交换菌株接种至不含卡那霉素的mrs液体培养基中，37℃，150～200rpm/min，培养12h，然后5000～10 000rpm/min离心浓缩菌液，浓缩比4∶1，将浓缩菌液涂布至含有蔗糖的mrs固体培养基平板，37℃培养24～48h，筛选得到阳性菌株，将阳性菌株分别对应点菌接种至mrs固体培养基平板和含有卡那霉素mrs固体培养基2种平板，37℃培养24～48h，筛选得到同源双交换的阳性克隆菌株l.rhamnosusatcc 11443-δldhd
ldhl-δrex；
17.步骤8：将重组菌株l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl-δrex接种至mrs液体培养基，37℃，150～200rpm/min，培养12h，然后以5％转接至新的mrs液体培养基，37℃，150～200rpm/min，进行乳酸发酵，发酵周期72h，发酵结束后测定发酵液的l-乳酸含量和产量。
aldhd
ldhl-δrex的构建验证图；
31.图3是本发明构建的敲除质粒pk18mobsacb-δrex图谱；
32.图4是本发明出发菌株(l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl
)和重组菌株(l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl-δrex)的l-乳酸发酵曲线图；
33.图5是本发明出发菌株(l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl
)和重组菌株(l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl-δrex)乳酸发酵的糖酸转化率对比图。
具体实施方式
34.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
35.实施例中鼠李糖乳杆菌l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl
为本实验室改造并保存，鼠李糖乳杆菌l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl
感受态细胞为本实验室制备；大肠杆菌e.coli dh5α为本实验室保存，大肠杆菌e.coli dh5α感受态细胞为本实验室制备；质粒pk18mobsacb为本实验室保存。
36.实施例中所使用的培养基和缓冲液。lb培养基(g/l)：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，ph7.0；mrs培养基(g/l)：葡萄糖20g，酵母粉5g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2.62g，柠檬酸氢二铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.056g，吐温801ml，自然ph值；smrs培养基：含0.5mol/l蔗糖mrs培养基。上述为液体培养基，各自的固体培养基为在相应的液体培养基基础上添加2％的琼脂，其中lb培养基的固体形式称为la培养基。smm缓冲液：蔗糖0.5mol/l，顺丁烯二酸0.2mol/l，氯化镁0.4mol/l，ph 7.0。
37.一种高产l-乳酸的鼠李糖乳杆菌基因工程菌的构建方法，所述方法包括如下步骤：
38.步骤1：geneious prime分析l.rhamnosus atcc 11443全基因组，定位目标rex基因及其上下游dna序列；
39.步骤2：根据l.rhamnosus atcc 11443的rex基因序列，设计rex-up-f、rex-up-r、rex-down-f和rex-down-r引物。rex-up-f/rex-up-r，rex-down-f/rex-down-r分别pcr扩增rex基因上游up-rex片段(1002bp)和下游down-rex片段(996bp)。up-rex和down-rex dna片段的pcr扩增结果如图1中的a所示。
40.步骤3：通过overlappcr将up-rex和down-rex片段进行拼接，得到拼接的δrex片段(1998bp)。将δrex片段t-a克隆至pmd20-t载体，电转化大肠杆菌e.coli dh5α(大肠杆菌感受态细胞按常规方法制备)，转化液涂布于含iptg、x-gal和氨苄青霉素的la培养基平板，37℃培养18h，蓝白筛选，得到中间质粒pmd20-δrex，以及携带中间质粒的菌株e.coli dh5α-pmd20-δrex。采用rex-up-f/rex-down-r引物pcr验证和ecor i/sph i内切酶验证构建的中间质粒。overlap pcr结果，以及构建的中间质粒的pcr、酶切验证结果如图1中的b、c所示。
41.步骤4：ecori和sph i双酶切中间质粒pmd20-δrex和自杀质粒pk18mobsacb，电泳、胶回收酶切的δrex和pk18mobsacb dna片段，并用t4 dna连接酶分别将酶切的δrex与
pk18mobsacb进行连接，连接产物电转化escherichia coli dh5a，转化液涂布于含iptg、x-ga1和卡那霉素的la培养基平板，37℃培养18h，蓝白筛选，得到敲除质粒pk18mobsacb-δrex，以及携带敲除质粒的菌株e.coli dh5α-pk18mobsacb-δrex。采用rex-up-f/rex-down-r引物pcr验证和ecor i/sph i内切酶酶切验证构建的敲除质粒，pcr和双酶切验证结果如图2中的a所示。构建的敲除质粒pk18mobsacb-δrex图谱如图3所示。
42.步骤5：同源重组。取50μl保存于-80℃的l.rhamnosusatcc 11443-δldhd
ldhl
甘油菌种涂布接种至mrs固体培养基平板，在37℃活化培养24h(一级培养)。取一级菌种转接到新的mrs液体培养基中，37℃，100rpm/min，培养24h(二级培养)。离心收集二级菌种，用新的mrs液体培养基洗涤菌体2次，并稀释涂布接种于mrs固体培养基平板，37℃，静置培养24h(单菌落培养)。挑取单菌落接种至新的mrs液体培养基中，37℃，150rpm/min，培养18h，按2％的比例转接至含有2％浓度甘氨酸的smrs液体培养基中，37℃，150rpm/min，培养至od
600
值为0.6，然后5000rpm/min，4℃离心10min收集菌体，再用预冷的15％的甘油液充分洗涤菌体细胞2次，最后用预冷的15％甘油液重悬菌体，得到l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl
的电转化感受态细胞。按每管80μl分装于1.5ml离心管中，-80℃冻存。
43.步骤6：冰浴操作，取0.5μg敲除质粒pkl8mobsacb-δrex与80μl l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl
电转化感受态细胞充分混合均匀，转移至冰上预冷的2mm电极杯中，进行电转化，电转化后快速加入预冷的不含吐温80的mrs复苏液1ml，混匀，然后转移至1.5ml离心管中，冰浴5min，转移至32℃培养3h(复苏培养)。取适量复苏培养菌液涂布含卡那霉素的mrs固体培养基平板，37℃培养48h，得到转化子。
44.步骤7：将转化子单菌落分别对应点菌接种至含有卡那霉素的mrs固体培养基平板和含有卡那霉素、蔗糖的mrs固体培养基2种平板，37℃培养36h，筛选同源单交换的阳性克隆菌株。将筛选得到的单交换菌株接种至不含卡那霉素的mrs液体培养基中，37℃，150rpm/min，培养12h，然后5000rpm/min离心浓缩菌液，浓缩比4∶1。将浓缩菌液涂布至含有蔗糖的mrs固体培养基平板，37℃培养48h，得到阳性菌株。将阳性菌株单菌落分别对应点菌接种至mrs固体培养基平板和含有卡那霉素mrs固体培养基2种平板，37℃培养36h，筛选得到同源双交换的阳性克隆菌株。采用rex-f/rex-r引物pcr验证δrex，得到基因工程重组菌株l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl-δrex。pcr验证结果如图2中的b所示。
45.步骤8：将重组菌株l.rhamnosusatcc 11443-δldhd
ldhl-δrex接种至mrs液体培养基，37℃，150rpm/min，培养12h，然后以5％接种量转接至新的mrs液体培养基，37℃，200rpm/min，进行乳酸发酵，发酵周期72h。发酵结束后测定发酵液的l-乳酸含量和产量。
46.图1为质粒pmd20-δrex的构建验证图：
47.a：m：1kb dna分子量标准；1：up-rex dna片段(1 002bp)；2：down-rex dna片段(996bp)。
48.b：m：1kb dna分子量标准；1：δrex dna片段(1 998bp)。
49.c：m：1kb dna分子量标准；1：ecor i/sphi双酶切质粒pmd20-δrex的dna片段(2 736bp，1 998bp)；2：pcr扩增质粒pmd20-δrex上的δrex dna片段(1 998bp)。
50.图2为质粒pk18mobsacb-δrex和重组菌l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl-δrex的构建验证图：
51.a：m：1kb dna分子量标准；1：ecor i/sph i双酶切质粒pk18mobsacb-δrex的dna
片段(5719bp，1 998bp)；2：pcr扩增质粒pk18mobsacb-δrex上的δrex dna片段(1 998bp)。
52.b：m：1kb dna分子量标准；1：pcr扩增菌株l.rhamnosusatcc 11443-δldhd
ldhl
上的rex基因(654bp)；2：pcr扩增重组菌l.rhamnosusatcc 11443-δldhd
ldhl-δrex上敲除的rex基因(654bp)(无)。
53.图3为构建的敲除质粒pk18mobsacb-δrex的图谱。
54.图4为l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl
菌株与l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl-arex的l-乳酸发酵曲线。
55.图5为l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl
菌株与l.rhamnosus atcc 11443-δldhd
ldhl-δrex的乳酸发酵糖酸转化率对比图。
56.如下为所用到的引物核苷酸序列信息：
57.表1为使用的引物信息表
58.primersequence(5
’‑3’
)rex-up-fcttgggcctggcgttcggcttrex-up-rccattatggtcttatgtaagcaagcctcctgtagaarex-down-fataagaccataatggcgtcgtttacctttagcaggcrex-down-rgcaaccgcatccacaaccagarex-fatggcggaaacgatcatccccrex-rtcaggcttctggttcgttgag
59.如下为敲除的rex的基因和氨基酸序列信息：
60.表2为rex的基因和氨基酸信息表
[0061][0062]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。