一种Rett综合征早期辅助诊断试剂盒

no.05-08所示，其靶位点依次为chrx：(+)18525125、chrx：(+)18525102、chrx：(+)18525182和chrx：(+)18525213；
11.foxg1 grna组包括第一至第四foxg1 grna，其针对靶标基因的序列依次如seq id no.09-12所示，其靶位点依次为chrx：(+)29236571、chrx：(+)29236756、chrx：(+)29237265和chrx：(+)29237217。
12.在本发明的一个优选实施方案中，所述mecp2 grna组由所述第一至第四mecp2grna组成。
13.在本发明的一个优选实施方案中，所述cdkl5 grna组由所述第一至第四cdkl5grna组成。
14.在本发明的一个优选实施方案中，所述foxg1 grna组由所述第一至第四foxg1 grna组成。
15.在本发明的一个优选实施方案中，所述cas9核酸酶为hifi cas9 nuclease v3。
16.grna组在制备rett综合征早期辅助诊断试剂盒中的应用，该grna组包括mecp2grna组、cdkl5 grna组和foxg1 grna组，其中，
17.mecp2 grna组包括第一至第四mecp2 grna，其针对靶标基因的序列依次如seq id no.01-04所示，其靶位点依次为chrx：(+)153296872、chrx：(+)153296464、chrx：(+)153357678和chrx：(+)153357714；
18.cdkl5 grna组包括第一至第四cdkl5 grna，其针对靶标基因的序列依次如seq id no.05-08所示，其靶位点依次为chrx：(+)18525125、chrx：(+)18525102、chrx：(+)18525182和chrx：(+)18525213；
19.foxg1 grna组包括第一至第四foxg1 grna，其针对靶标基因的序列依次如seq id no.09-12所示，其靶位点依次为chrx：(+)29236571、chrx：(+)29236756、chrx：(+)29237265和chrx：(+)29237217。
20.在本发明的一个优选实施方案中，所述mecp2 grna组由所述第一至第四mecp2grna组成。
21.在本发明的一个优选实施方案中，所述cdkl5 grna组由所述第一至第四cdkl5grna组成。
22.在本发明的一个优选实施方案中，所述foxg1 grna组由所述第一至第四foxg1 grna组成。
23.在本发明的一个优选实施方案中，所述mecp2 grna组由所述第一至第四mecp2grna组成，所述cdkl5 grna组由所述第一至第四cdkl5 grna组成，所述foxg1 grna组由所述第一至第四foxg1 grna组成。
24.本发明的有益效果是：本发明可以测多个位点，灵敏度高，操作简便，可以同时检测这些基因是否有甲基化修饰突变，可快速进行rett综合征的早期辅助诊断。
具体实施方式
25.以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
26.实施例1
27.1、样本dna提取
28.抽取15例rett综合征患者和15例健康人的血液样本各2ml，共30例，将抽取的血液样本分别用磁珠纯化基因组dna。提取完后对基因组dna进行完整性，浓度及纯度测定；测定过程中如电泳条带无弥散，则证明所提取的dn完整，未降解；用紫外分光光度计检测dna的纯度，通常情况下，高纯度的dna其od260/280应介于1.8-2.0之间；用qubit3.0检测dna的浓度。将测定过的，完整且未降解的dna溶液置于-20℃冰箱保存备用。
29.2、gdna设计
30.选择mecp2，cdkl5和foxg1作为靶标基因，利用http：//crispr-era.stanford.edu网站对靶标基因设计guide rna(g rna)，每个基因设计十个g rna，并选择最高的预测靶上性能和最小的脱靶活性。全部g rna的信息如下表1所示。tracrrna购买于idt公司，货号1072532。
31.表1
[0032][0033]
3、rnp组装
[0034]
在组装grna之前，将所有crrna等摩尔混合，总浓度为100μm。将crrna混合物与tracrnas混合，使tracrrna浓度和crrna总浓度均为10μm。将grna双链在95℃变性5min，室温冷却5min。在1
×
cutsmart buffer(new england biolabs)中将10pmol的grna双链与10pmol的hifi cas9 nuclease v3(idt)结合构建rnps，最终体积为30μl(浓度333nm)，室温孵育20min，4℃保存至使用，最长可保存2d。
[0035]
4、cas9剪切及文库制备
[0036]
将3μgdna重悬于30μl的1
×
cutsmart buffer(new england biolabs)中，用3μl quick cip酶(new england biolabs)，37℃加热10min，然后在80℃加热2min使碱性磷酸酶(cip)酶失活。待样品恢复室温后，加入10μl预组装的333nm cas9 grna复合物，1μl 10mm datp(zymo)和1μltaq dna聚合酶(new england biolabs)，用于dna末端的a尾。在37℃孵育20min，72℃下孵育5min。测序适配器和连接缓冲液购自牛津纳米孔连接测序试剂盒(oxford nanopore technologies，lsk109)。用quick ligase(new england biolabs，m2200)室温孵育10min进行dna末端连接。之后使用0.3
×
ampure xp磁珠(beckman coulter，a63881)，进行回收，最后用15μl洗脱缓冲液洗脱。在洗脱液中加入25μl的测序缓冲液，9.5μl装载微珠和0.5μl测序tether，完成测序文库构建。
[0037]
5、上机测序
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样品使用minion(v.9.4.1)芯片，minknow软件进行测序(v.20.2.2)。
[0039]
6、数据分析
[0040]
运用不同的分析软件可以快速的分析出每个基因的所有突变碱基及其发生的甲基化修饰。测序经过basecalling后转换成fsatq文件，所有reads与hg38基因组进行比对，运用nanopolish软件进行甲基化修饰预测，碱基缺失突变运用sv caller sniffles软件进行分析。最终，根据软件分析结果，筛选出mecp2，cdkl5及foxg1基因上突变位点如下表2所示，结果显示本发明检测结果与临床检测结果一致，rett综合征患者在表中的位点处有突变，而正常人没有。说明本发明可以较好的作为rett综合征早期发现和治疗的辅助手段。
[0041]
表2
[0042]
[0043][0044]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。