不结球白菜BcERF070基因的基因工程应用

本发明属于分子生物学和生物，具体涉及不结球白菜bcerf070基因调控不结球白菜vc含量中的应用。

背景技术：

1、植物中维生素c(vitamin c，以下简称vc)又称l-抗坏血酸(l-ascorbic acid，asa)，在植物自身的抗氧化系统、光合保护以及调节生长发育中起到至关重要的作用，更为我们提供了丰富而方便的vc补充。针对植物中的vc合成的研究一直在进行中，通过基因工程技术提高asa含量，探索基因功能是当前研究的热门方向。

2、不结球白菜在植物学上属于十字花科芸薹属植物，常规育种方法受限于种质资源的匮乏，难有作为，而植物基因工程技术可以突破物种间的界限，转移外源的有用基因，为芸薹属作物改良提供了新途径。芸薹属植物常用的遗传转化方法有农杆菌介导法、基因枪法、电击法等，其中农杆菌介导法应用最广泛，方法最成熟。农杆菌介导法转基因技术就是使分别含有ti质粒和ri质粒的根癌农杆菌和发根农杆菌携带目的基因，利用农杆菌诱导植物伤口产生冠瘿瘤或发状根的特性，将质粒上t-dna携带的目的基因插入到植物基因组中，再通过组织培养技术，再生出携带目的基因的转基因植株的技术方法。1988年，zhang等发现芸薹属作物的再生与基因型密切相关。1990年boulter在甘蓝型油菜的遗传转化研究中发现，根癌农杆菌有比发根农杆菌更高的转化频率，从此芸薹属蔬菜遗传转化体系的研究开始不断取得新进展，积累了丰富的研究材料。

3、如何通过基因工程获得突变体验证基因功能、调控不结球白菜中的vc含量，进而创造不结球白菜新种质具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、本研究验证了该基因在vc合成途径中的重要作用，成功获得该基因的基因编辑突变体植株，与野生型植株相比，基因编辑植株的bcerf070基因序列碱基发生替换，植株vc含量随之下降。为之后通过基因工程提早不结球白菜开花时间、缩短育种周期、创造蔬菜新种质提供了理论依据和实践依据。

2、本发明的第一个目的是提供不结球白菜bcerf070基因的基因工程应用，敲除bcerf070基因，能够降低不结球白菜vc含量。

3、本发明的第二个目的是提供不结球白菜bcerf070基因的基因工程应用，敲除bcerf070基因，能够提早不结球白菜开花时间。

4、进一步的，前述应用中，所述bcerf070基因的核苷酸序列如seq id no.1所示：atgaagcgaatcgtgaggatatcattcaccgacgtggaggccaccgattcttccagcagcgaagacgatcagacgaacaccgaatcaccgtcgccacgaaaagggaagaggttcgtcaaggagatcgtcatcgacccatccgattccgccgaggtgagaaagacgcggtttaagatcaggattccggcgaggcttacgaagaagttccgaggtgtgaggcagaggccgtgggggaaatgggcggctgagatcaggtgcggtaaagctcacggtggaattcgcaacgggggacctgttcgtctttggcttgggacattcgaaaccgccgaggaagctgctttggcttacgacaaggccgcgattcggcttattgggcctcacgcgccgatcaatttcggcccagaatctccggctgtgaagcaagattccgttgcgggggactga

5、进一步的，前述应用中，所述敲除bcerf070基因为将bcerf070基因crispr/cas9载体导入不结球白菜，导致bcerf070基因序列改变，失去作用。

6、在某一个特定的实施例中，敲除bcerf070基因具体包括如下步骤：

7、(1)bcerf070基因crispr载体构建

8、根据在线网站http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr设计sgrna，将seq idno.1所示bcerf070的序列输入网站，得到一系列长为20bp的序列，设计sgrna：gtgtgaggcagaggccgtgg(seq id no.2)，5’-ngg-3’为pam(所述n代表任一碱基)。

9、上述seq id no.1所示bcerf070基因核苷酸序列中，下划线处为seq id no.2所示sgrna，加粗处为pam。

10、选择pam结构前二十个碱基作为前引物，反向互补作为后引物，设计sgrna引物，分别是，从5’-3’：

11、sgrna-1-f:gattgtgtgaggcagaggccgtgg(seq id no.3)

12、sgrna-1-r:aaacccacggcctctgcctcacac(seq id no.4)

13、5μl sgrna-1-f+5μl sgrna-1-r直接退火；

14、程序：第一步，95℃，3min；第二步，95℃，1min；第三步，回到步骤二，每次下降1℃，重复40次；第四步，55℃，30min；第五步，55℃，1min；第六步，回到步骤五，每次下降1℃，重复30次；最后4℃保存。

15、将退火产物连到bpi 1单酶切的pmd18-t质粒(含有psgr-cas9-at，由浙江大学提供)上，体系为退火产物2μl、载体2μl、5×buffer 2μl、t4连接酶1μl、h2o 3μl，连接产物转化大肠杆菌；提取带有片段的pmd18-t质粒后酶切(酶切位点kpn1和hindiii)连接到kpn1和hindiii酶切过的pcambia1301上，连接产物转化大肠杆菌；测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确，得到crispr载体。

16、(2)植物表达载体质粒转化农杆菌

17、将(1)得到的crispr载体分别加入到感受态农杆菌，混匀后冰浴10min，随后液氮速冻5min，迅速移至37℃水浴中5min，冰浴5min，加入900ul新鲜的lb液体培养基，于28℃，250rpm振荡培养2～3h，然后6000rpm离心5min，留取100ul左右上清吹打重悬菌液，涂布于含50mg/l卡那霉素和20mg/l利福平的lb固体培养基，28℃暗培养2-3d直到平板上长出单菌落，pcr鉴定后获得携带有crispr/cas9基因编辑载体的农杆菌gv3101。

18、(3)农杆菌介导法转化不结球白菜

19、①无菌苗的获得：将种子用75％酒精(无水乙醇与灭菌水体积比为3:1配制)振荡2分钟，再用次氯酸钠(吸取5.6％次氯酸钠溶液1ml，灭菌水9ml混合)振荡15分钟消毒，无菌水清洗后用滤纸吸干水分播种到发芽培养基，放到光培箱培养5～7天，至幼苗子叶完全展开。

20、②获得无菌外植体：将步骤①剪取带柄子叶及下胚轴，作为外植体平铺于预培养基，光培箱培养3天。

21、③外植体与农杆菌共培养：将②得到的农杆菌od600调为0.2，在28℃摇床，250rpm振荡3h后，侵染外植体8min，用无菌滤纸吸去多余的农杆菌液，置于共培养基(垫无菌滤纸)，于光培箱暗培养3天。

22、④获得植株：将经过共培养的外植体转移到分化培养基，光培箱培养20-30天后将单个芽转移至筛选培养基进行筛选培养，约20d后选择绿色的不定芽转移到生根培养基，约20d根系健壮后炼苗移栽。

23、⑤转基因植株检测：体式镜荧光检测根部或桑格测序法。

24、步骤①发芽培养基条件为1/2ms，琼脂7g/l，蔗糖30g/l，ph值为5.8，不添加激素。

25、步骤①选用酒精和次氯酸钠为消毒液，所述酒精浓度为75％，可通过以下方法制备所得：无水乙醇与灭菌水体积比为3:1配制；所述次氯酸钠溶液有效氯含量为0.56％，可通过以下方法制备所得：吸取5.6％次氯酸钠溶液1ml，灭菌水9ml混合。

26、步骤①中次氯酸钠消毒时间为15分钟，且消毒后用无菌水清洗5次，每次10秒。

27、步骤①中播种后在光培箱中培养5天，此时幼苗子叶已完全展开。

28、步骤②中选取的外植体材料为带柄子叶和下胚轴，下胚轴长度为0.5cm，带有1～2mm子叶柄的子叶及5mm左右的下胚轴更容易生成愈伤分化出芽。

29、步骤②中获得外植体后光培箱培养时间为3天，此过程有助于伤口产生愈伤细胞，减少共培养后褐化几率。

30、步骤②中预培养基配比为：ms培养基、7g/l琼脂、30g/l蔗糖、3mg/l噻苯隆(tdz)、0.25mg/l萘乙酸(naa)、7.5mg/l agno3，ph值为5.8。

31、本发明步骤③中为先将步骤②得到的农杆菌在4000rpm，10min离心一次之后，去上清液，采用农杆菌悬浮液重悬浮。

32、本发明步骤③中农杆菌悬浮液为1/10ms液体培养基，配制方法为：0.474g/l ms培养基、3g/l蔗糖，ph为5.2。

33、本发明步骤③中农杆菌悬浮液在使用前要添加乙酰丁香酮(as)，终浓度为100mmol。

34、本发明步骤③中农杆菌od600为0.2，之后在28℃摇床，250rpm振荡3h，外植体侵染时间为8分钟，此时转化效率高又不会对外植体造成过多伤害。

35、本发明步骤③中共培养基使用时垫无菌滤纸。

36、本发明步骤③中共培养时间为3天，且在黑暗条件下进行，可以有效控制农杆菌的生长。

37、本发明步骤③中共培养基配比为：ms培养基、7g/l琼脂、30g/l蔗糖、3mg/l tdz、0.25mg/l naa、7.5mg/l agno3，ph值为5.2。

38、本发明步骤④中分化时间为20～30天，继代培养和生根培养各20d左右。

39、本发明步骤④中分化培养基配比为：ms培养基、7g/l琼脂、30g/l蔗糖、3mg/l tdz、0.25mg/l naa、5mg/l agno3、160mg/l carb、160mg/l特美汀、0.2mm vc，ph值为5.8，该培养基简单有效，一次分化培养后就可以形成愈伤和芽，并且玻璃化及褐化少。

40、本发明步骤④中筛选培养基配比为：ms培养基、7g/l琼脂、30g/l蔗糖、2mg/l 6-ba、0.1mg/l naa、7.5mg/l agno3、160mg/l carb、160mg/l特美汀、0.2mm vc、5mg/l hyg(潮霉素)，ph值为5.8。

41、本发明步骤④中生根培养基配比为：ms培养基、7g/l琼脂、30g/l蔗糖、0.2mg/lnaa、7.5mg/l agno3、160mg/l carb、160mg/l tim，ph值为5.8。

42、本发明步骤①～④中光培箱环境为(25±5℃)16h光照8h黑暗，光照度5000lx。

43、有益效果

44、vc对人体及植物本身都具有非常重要的作用，本发明通过基因工程探究不结球白菜体内的vc合成通路，对不结球白菜进行遗传改良。

45、本发明通过基因编辑技术实现了植物体内的bcerf070基因的碱基替换，不结球白菜体内vc含量降低，并进而提早不结球白菜开花时间，缩短育种周期。可操作性强，实验周期短，且目标性状单一，获得的转基因植株与非转基因对照相比，bcerf070基因发生突变后，vc含量相比较对照组(未编辑植株)下降了37.5％，验证了bcerf070基因在植物vc合成途经中的重要作用。本发明通过基因工程技术调控不结球白菜的vc含量，为创造白菜类蔬菜的新种质和遗传改良提供了新思路和技术支持，具有重要的现实意义。