一种莽草酸发酵液的脱色处理方法
1.技术领域
2.本发明属于莽草酸生产技术领域，具体涉及到一种有效的莽草酸发酵液的脱色处理方法。
背景技术：
3.莽草酸是一种存在于天然植物如八角茴香和一些裸子植物果实中的环状有机酸。外观呈白色粉末，易溶于水，在水中的溶解度为18g/100ml，难溶于氯仿、苯和石油醚。是抗禽流感药物达菲的关键原料，具有抗炎、镇痛作用，是二恶霉素、乙二醛酶抑制剂等抗病毒和抗肿瘤药物的合成原料。
4.自从who将奥司他韦推荐为重要的抗流感病毒药物以来，医药原料行业对于莽草酸的需求量在极速增长。市场上的莽草酸多从植物中提取而来，但是植物中的莽草酸含量有限，远不能满足莽草酸市场需求。多家生产企业都因为植物原材料料的竞争而停产，为降低对八角等植物头材料的严重依赖性，开发高效的莽草酸生产途径成为研究热点。
5.目前，莽草酸的生产方法主要有3种：（1）植物提取法：含包扩溶剂浸提法、热回流提取法、超声波提取法、微波辅助提取法、分子印迹技术提取、超临界二氧化碳萃取等现代植物有效成分提取技术。直接提取的方法，有机溶剂消耗较大、设备费用较高、植物材料供应不确定等因素不利于莽草酸的可持续生产。（2）化学合成法：碳氢化合物转化法、奎宁酸转化法、diels-alder反应。化学合成的原始材料难得且价格昂贵，合成工艺繁琐，容易产生大量难以分离的杂质，并且产生的化学废弃物容易污染环境，限制了莽草酸的工业合成。（3）微生物发酵合成法：大肠杆菌利用莽草酸途径合成莽草酸具有生产周期短、能耗小、低成本、高产量优势，具有广阔的应运前景。
6.从发酵液中提取莽草酸是微生物工程发酵法生产莽草酸的关键工序。目前最常用的离子交换树脂提取纯化工艺主要存在以下两个问题，一是树脂对莽草酸的吸附量特别低，收率低，不同批次收率波动很大，二是由于莽草酸发酵液颜色较深，发酵液成分较为复杂，导致洗脱液颜色太深，粗成品中色素残留严重，大大降低了产品质量。因此，要想获得质量达标的莽草酸产品，有效去除发酵液中的强结合负电色素杂质，对进一步提高阴离子交换树脂的精纯步骤的处理量、洗脱收率和纯度至关重要。
技术实现要素：
7.为解决莽草酸在生物发酵生产中色素残留严重的共性问题，本发明提供了一种充分利用混合液物化性质的发酵液处理方法，该方法可以有效去除莽草酸发酵液中色素大分子，使回收液透光率达到较高水平，提高后续了离子交换精纯分离效率和产品纯度。
8.本发明是通过如下技术方案来实现的。
9.一种莽草酸发酵液的脱色处理方法，其包括如下步骤：
离心沉降菌体、过滤大分子蛋白、酸碱沉淀蛋白、板框过滤、一次搅拌脱色、板框过滤、二次搅拌脱色、板框过滤、弱碱阴离子交换树脂脱色、检测。
10.进一步地，所述脱色处理方法包括如下步骤：1）离心沉降菌体：将莽草酸发酵液采用平板离心机离心，收集清液；2）过滤大分子蛋白：用浓硫酸调节ph，以流速30-50ml/min过陶瓷膜过滤，进出压力差0.06-0.08mpa；温度35-40℃；3）酸碱沉淀蛋白：将步骤2）中收集的过滤液水浴升温到52℃，边搅拌边用ca(oh)2调节ph，保温2h，充分沉淀碱性蛋白和杂质阴离子；4）板框过滤：将步骤3）处理后的液体板框循环过滤；5）一次搅拌脱色：边搅拌滤液边加入浓硫酸约60ml，调节ph至2.5；水浴锅中升温至52℃，搅拌加入30g活性炭，3.3gedta，250rpm/min，恒温搅拌脱色2h；6）板框过滤：搅拌脱色结束，脱色液室温静置30min，板框循环过滤；7）二次搅拌脱色：步骤6）所得过滤液水浴保温到52℃左右，加入30g粉状活性炭，250rpm/min搅拌脱色2h；8）板框过滤：搅拌脱色结束，脱色液室温静置30min，板框循环过滤；9）弱碱阴离子交换树脂脱色：步骤8）所得过滤液采用阴离子交换树脂过柱，当柱子输出口液体ph升到9.0时开始收集，共收集约2.9l清液；10）检测：用分光光度计测定脱色率，用高效液相色谱测损失率。
11.优选地，所述步骤1）中，平板离心机以1400rpm/min离心。
12.优选地，所述步骤2）中，浓硫酸调节ph至4.5。
13.优选地，所述步骤3）中，用ca(oh)2调节ph至10.5左右。
14.优选地，所述陶瓷膜为微滤膜，瓷膜模芯是多孔支撑层、过滤层及微孔膜层呈非对称分布，模芯孔径为0.2um，过滤参数控制压差0.06-0.08mpa、温度35-40℃、ph4.0-4.5，料液流速为30-50ml/min。
15.优选地，所述弱碱性阴离子结合树脂为lka96弱碱性阴离子结合树脂。
16.优选地，所述弱碱性阴离子结合树脂在使用前用4%（w/v）naoh再生处理。
17.优选地，所述步骤9）中，过柱料液参数控制在ph为2.5-3.0；温度为20℃-30℃；上柱流速为0.5-0.6bv/h。
18.本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：1、本发明采用先大后小、逐级过滤、物化性质相结合的纯化方法去除色素大分子，其生产工艺简洁、便于操作、设备配置要求较低，可进行连续性工业生产。
19.2、本发明的整个脱色过程均使用基础可循环设备，在达到对发酵液高效脱色的同
时也除去了发酵液中绝大多的杂质分子，为后续离子交换和目的产物的富集回收创造了条件。不依赖于化学提取试剂和成本较高的耗材，保证了环保要求，降低了环境污染，节约了能源。
20.3、本发明先除去菌体碎片、絮凝状块等大分子后，在活性炭最佳脱色条件下连续两次脱色，最后再使用对负电色素分子具有较强吸附性能的阴离子交换树脂lka96进行吸附，整个工艺过程使料液的脱色率高达90%以上，达到高效脱色的需求。
具体实施方式
21.为了使本技术领域的人员更好地理解本技术中的技术方案，下面将结合本技术具体实施例，对本技术方案进行完整地描述。
22.实施例1一种莽草酸发酵液的脱色处理方法，其包括如下步骤：3）大肠杆菌工程菌种子从摇瓶接入发酵罐，最优发酵条件下发酵70h，检测产酸为75mg/ml。取此刻发酵液2000ml，平板离心机1400rpm/min离心收集清液。
23.4）用浓硫酸调节ph至4.5，以流速30-50ml/min过陶瓷膜过滤设备（sunstar），进出压力差0.06-0.08mpa；温度35-40℃。
24.3）将步骤2）中收集的清液水浴升温到52℃，边搅拌边用ca(oh)2调节ph至10.5左右，保温2h，充分沉淀碱性蛋白和杂质阴离子。
25.4）将步骤3）处理后的液体板框循环过滤。
26.5）抽滤液边搅拌边加入浓硫酸约60ml，调节ph至2.5。水浴锅中升温至52℃，搅拌加入30g活性炭，3.3gedta，250rpm/min，恒温搅拌脱色2h。
27.6）搅拌脱色结束，脱色液室温静置30min，板框循环过滤。
28.7）步骤6）所得过滤液水浴保温到52℃左右，加入30g粉状活性炭，250rpm/min搅拌脱色2h。
29.8）搅拌脱色结束，脱色液室温静置30min，板框循环过滤。
30.9）步骤8）所得过滤液，测得ph为约2.7，室温26℃，流速为0.5-0.6bv/h过lka96阴离子交换树脂,树脂用前已经用4%naoh再生处理。当柱子输出口液体ph升到9.0时开始收集，料液过完后用1bv的蒸馏水顶料，共收集约2.9l清液。
31.10）用分光光度计分别测定处理前料液和处理完后收集液在420nm处的透光率，计算该批次脱色率为94.5%；用高效液相色谱测处理前料液莽草酸（m0）和处理完后收集液中莽草酸含量（m），计算该批次莽草酸损失率：s/%=(m
0-m)/m0；损失率为4.8%，损失率较低，收率达到95%以上。
32.以上列举的仅是本发明的一项例具体实施例。本发明不限于以上一批实验例，还可以有许多延伸和变形。从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。