一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉花耐盐基因发现方法及其应用

1.本发明涉及植物遗传技术领域，尤其涉及一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉花耐盐基因发现方法及其应用。


背景技术：

2.全球大约有20％的土壤受到盐渍化的影响，而且趋势在不断的恶化。据估计到2050年，超过50％的耕地将发生盐渍化，严重浪费了大片的土地，同时也严重影响了农作物产量。我国也有着大片的盐地与碱地，其组成复杂，程度不同，容易使人们混淆，所以统称为盐碱地。事实上，土壤盐碱化的主要特征是盐度和ph值的增加，不仅仅是某一种单一的非生物胁迫。盐含量过高会使植物植株受到严重损害甚至死亡。培育耐盐品种植物，提高植物耐盐能力，是利用盐碱地的一种有效的生物方法；同时还能产生较好的生态效益和经济效益，促进农业的可持续发展。
3.转录组测序是研究差异基因表达、功能注释、代谢调控预测、检测snp位点的方法；当前在棉花研究中也已得到广泛应用。棉花基因组测序的重大进展，为基因挖掘、功能注释奠定了基础，综合利用基于高通量第二代测序技术的转录组测序能够更加快速的确定候选基因，探究棉花耐盐性的分子机制。
4.蛋白质组学是对组织和细胞中所含的所有蛋白质的研究。蛋白质组学技术系统为全面研究植物在盐胁迫下的相关代谢过程和信号通路提供了可能。随着基因组研究发展的日益成熟，植物蛋白质组学也取得了很大的进步。差异蛋白质组学主要是从功能模式研究特定的蛋白质表达，成为植物生理、发育和遗传学的重要研究方法和工具。识别不同品种或不同状态的植物样品之间蛋白质组的差异和变化，利用差异蛋白质组学研究植物在逆境下的表现及其适应方法，为分析植物对逆境的响应提供了可能。
5.随着后基因组学越来越广泛的使用，转录组学与蛋白组学等高通量组学研究方法与分析技术越来越成熟，联合分析的方法已经被大量应用在植物研究领域。由于生物体与所处环境是环环相扣的，普通的研究无法全面的解释植物在短时间内对环境的响应；而将转录组与蛋白组联合分析，可以更完整地了解蛋白质与转录水平相互调控机制，认识生物体内部复杂的生理生化反应，将生命活动的内在规律与外在环境联系到一起。
6.本技术前期选育的四倍体陆地棉“通盐一号”表现出较强的耐盐性，适合于低度盐碱地种植。本技术对盐胁迫下的“通盐一号”进行转录组和蛋白组学联合分析，鉴定棉花盐胁迫相应的关键基因与重要通路，有助于棉花耐盐候选基因的发掘和分子标记开发，对选育耐盐棉花品种，开发利用盐碱地具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉花耐盐基因发现方法及其应用。
8.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
9.一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉花耐盐基因的发现方法，所述棉花耐盐基因包括棉花耐盐基因gh_d10g0907和棉花耐盐基因gh_d11g0978，所述棉花耐盐基因gh_d10g0907和棉花耐盐基因gh_d11g0978分别位于棉花d11和d10号染色体。
10.优选地，所述棉花耐盐基因gh_d10g0907和棉花耐盐基因gh_d11g0978的cdna序列信息如下：
11.》gh_d10g0907.1
12.atggcttcagtgaatctgggctctttggttcaatcatactccattttcaaccaagcttccagaaacaattccaagtcttttcctttacccagatcctttcccttcaatcccctcaagaatatctcatcttcaactcccaaaagacgtagctttacatctcttccttcgatatcctcagtccttaccaaagaagacgcggtcatggaagaagaccaagaccctcaattaccaagttttgatttcaaatcattcatgatacacaagggtaatgcagttaaccaagccctggactcggctgttccactccgtgaccctgttaaaatccatgaagcaatgcgttactcccttttagccggtggcaaaagggtccgcccagttctttgtttggctgcttgtgaccttgttggtggcaaagaatccatggttatgccagcagcttgtgctcttgaaatgatccacaccatgtctttagtccacgatgatcttccttgcatggacaacgatgatcttcgtagagggaaaccaactaaccacaaagtttatggtgaagatatagctgtgttagcaggggatgctcttttagccttttcgtttgaacatatagctgtatccacagttggtgtcacacctgataggattgtaagagcaattggggaattagctaaatctattggggctgaagggttggcggctggtcaagttgtggatataaccagtgagggtctaaccaatgtggggttggatcatttagaattcattcatgttcataaaactgctccattgcttgaagcagctgcggttttaggggctattcttggaggtggacatgatgaagatgtggaaaagttgaggaaatttgcaaggaatattgggcttttatttcaagttgtggatgatattcttgatgtaacaaagtcatctaaagaattagggaagactgcagggaaagatttggtggctgataaagtgacttatcctaaatcgatggggataaacaaatcaaaggagtttgcagagaagttgaagagtgatgcattagagttgcttcaagggtttgatcctgagaaatctacccccttaattgctttagctaattatatagcttacaggcaaaattag
13.》gh_d11g0978.1
14.atgtcgcagttgttggagaaggcgaaggacttcgtggtggataaggtggccaacataaagaagccggaggctagtgtctcggacgttgatctgaaacatgtgagccgtgagtgcgtcgagtatggcgctaaggtctctgtctccaacccctacagccattccatccccatttgtgagatctcttacaatttcaaaagtgctggaagagggatagcatcagggacaataccagacccggggtcattgaaagccggcgacacaacgatgctggacgtgccagtgaaggtgccgtataacatcttagtaagcttggcaaaggatattggtgcagattgggacattgactatgaattggaattgggtctcaccattgatcttcctatcatggggaacttcactatccctctctctcagaaaggagagatcaagcttcctactctcagtgacatcttttag
15.优选地，一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉花耐盐基因的发现方法，包括以下步骤：
16.步骤1、转录组与蛋白组测序及联合分析
17.种植耐盐棉花品种“通盐一号”，相同环境下当棉花幼苗生长到四叶期时，选取6株生长状态良好且形态相近的幼苗分为两组，一组为对照组，一组为实验组，实验组每天下午5点浇250mmol/l的nacl溶液200ml；对照组浇等量的蒸馏水，两天后，将对照组三株分别取真叶标记为ck1、ck2、ck3，同样将实验组3株分别取真叶标记为salt1、salt2、slat3，最后将6个样进行干冰冷冻然后送北京组学生物公司分别提取rna进行转录组测序、提取蛋白进行蛋白组测序。
18.通过对转录组与蛋白组的联合分析，一共得到了24个共性的差异表达基因，这24个基因在转录组与蛋白组结果中均显著差异表达。通过对目的基因的注释与比对，盐胁迫前后表达量差异倍数比对，并且对基因功能进行总结，得到两个显著差异表达的基因gh_d10g0907与gh_d11g0978，且在其他物种中发现有明显耐盐性。gh_d10g0907作为甘油葡萄糖苷磷酸合成酶将甘油-3-磷酸和adp-葡萄糖经甘油葡萄糖苷磷酸合成酶(ggps)合成甘油葡萄糖磷酸，在藻类与微生物中是一种已知的耐盐基因。gh_d11g0978基因是一类胚胎发育相关(lea)的基因，同时也参与调节渗透，是已知的一类抗胁迫基因，在多种农作物中都有发现有耐盐耐旱耐寒的作用，比如玉米小麦等作物。于是将两个基因确定作为目的基因，并对其耐盐功能进行验证。
19.步骤2、耐盐基因的表达模式及功能验证
20.步骤2.1、对于上述耐盐候选基因，利用primer5进行引物的设计并合成，将rna反转录为cdna，利用实时定量pcr进行表达模式验证；
21.步骤2.2、在棉花中开展候选基因的基因克隆与基于病毒介导沉默(virus-induced gene silencing，vigs)的功能验证。gh_d10g0907全长1119bp、编码氨基酸372个，属于ggps家族。gh_d11g0978全长456bp、编码氨基酸151个，属于lea家族。这两个家族在不同的物种中均有耐盐性相关验证。用vigs技术获得了gh_d10g0907和gh_d11g0978的基因沉默植株，对沉默植株进行盐处理后，沉默植株出现早枯萎与较大程度的盐害表型，而且沉默植株对比对照组活性氧含量更高，因此认为这两个基因在陆地棉盐胁迫下有着重要的作用。
22.本发明还提供了一种采用上述的发现方法的棉花耐盐基因gh_d10g0907和棉花耐盐基因gh_d11g0978在分子标记辅助选育耐盐棉花品种中的应用，利用这两个基因，可分子标记辅助选育耐盐棉花品种。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.本发明以棉花耐盐品种通盐一号为材料，对其开展盐胁迫及对照下的转录组测序及蛋白组测序，通过二者联合分析初步确定耐盐候选基因，并对耐盐差异基因进行rt-qpcr表达分析，最后在棉花中开展vigs功能验证，最终得到的棉花耐盐基因gh_d10g0907和gh_d11g0978分别位于d10、d11号染色体上；该基因可通过分子辅助育种转移到农艺性状优良的棉花材料，进而创制耐盐且农艺性状优良的棉花材料或品种。
附图说明
25.图1为本发明中盐胁迫下差异表达耐盐基因的rt-qpcr表达验证结果图。
26.图2为本发明中vigs验证实验中盐胁迫下四组棉花的表型差异对比图。注：ptrv:00为空白载体，代表阴性对照；ptrv：ghcla1转入了ghcla基因，即棉花内源叶绿体形成相关基因(cotton cloroplastos alterados 1，ghcla1,420bp)；ghcla沉默后，棉花叶片会出现白化表型；因此，将沉默ghcla基因的植株作为阳性对照。ptrv:gh_d10g0907与ptrv:gh_d11g0978代表实验组(转入gh_d10g0907与gh_d11g0978基因)。
具体实施方式
27.下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领
域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉花耐盐基因的发现方法，所述棉花耐盐基因包括棉花耐盐基因gh_d10g0907和棉花耐盐基因gh_d11g0978，所述棉花耐盐基因gh_d10g0907和棉花耐盐基因gh_d11g0978分别位于棉花d11和d10号染色体。
29.其中，所述棉花耐盐基因gh_d10g0907和棉花耐盐基因gh_d11g0978的cdna序列信息如下：
30.》gh_d10g0907.1
31.atggcttcagtgaatctgggctctttggttcaatcatactccattttcaaccaagcttccagaaacaattccaagtcttttcctttacccagatcctttcccttcaatcccctcaagaatatctcatcttcaactcccaaaagacgtagctttacatctcttccttcgatatcctcagtccttaccaaagaagacgcggtcatggaagaagaccaagaccctcaattaccaagttttgatttcaaatcattcatgatacacaagggtaatgcagttaaccaagccctggactcggctgttccactccgtgaccctgttaaaatccatgaagcaatgcgttactcccttttagccggtggcaaaagggtccgcccagttctttgtttggctgcttgtgaccttgttggtggcaaagaatccatggttatgccagcagcttgtgctcttgaaatgatccacaccatgtctttagtccacgatgatcttccttgcatggacaacgatgatcttcgtagagggaaaccaactaaccacaaagtttatggtgaagatatagctgtgttagcaggggatgctcttttagccttttcgtttgaacatatagctgtatccacagttggtgtcacacctgataggattgtaagagcaattggggaattagctaaatctattggggctgaagggttggcggctggtcaagttgtggatataaccagtgagggtctaaccaatgtggggttggatcatttagaattcattcatgttcataaaactgctccattgcttgaagcagctgcggttttaggggctattcttggaggtggacatgatgaagatgtggaaaagttgaggaaatttgcaaggaatattgggcttttatttcaagttgtggatgatattcttgatgtaacaaagtcatctaaagaattagggaagactgcagggaaagatttggtggctgataaagtgacttatcctaaatcgatggggataaacaaatcaaaggagtttgcagagaagttgaagagtgatgcattagagttgcttcaagggtttgatcctgagaaatctacccccttaattgctttagctaattatatagcttacaggcaaaattag
32.》gh_d11g0978.1
33.atgtcgcagttgttggagaaggcgaaggacttcgtggtggataaggtggccaacataaagaagccggaggctagtgtctcggacgttgatctgaaacatgtgagccgtgagtgcgtcgagtatggcgctaaggtctctgtctccaacccctacagccattccatccccatttgtgagatctcttacaatttcaaaagtgctggaagagggatagcatcagggacaataccagacccggggtcattgaaagccggcgacacaacgatgctggacgtgccagtgaaggtgccgtataacatcttagtaagcttggcaaaggatattggtgcagattgggacattgactatgaattggaattgggtctcaccattgatcttcctatcatggggaacttcactatccctctctctcagaaaggagagatcaagcttcctactctcagtgacatcttttag
34.具体的，本发明以棉花耐盐品种通盐一号为材料，对其开展盐胁迫及对照下的转录组和蛋白组联合分析，初步确定耐盐候选基因，并对耐盐差异基因进行rt-qpcr表达分析，最后在棉花中开展功能验证。具体步骤如下：
35.参照图1-2，一种获得基于转录组和蛋白组联合分析的棉花耐盐基因的发现方法，包括以下步骤：
36.步骤1、蛋白组与转录组测序及联合分析
37.种植耐盐棉花品种“通盐一号”，相同环境下当棉花幼苗生长到四叶期时，选取6株生长状态良好且形态相近的幼苗分为两组，一组为对照组，一组为实验组，实验组每天下午5点浇250mmol/l的nacl溶液200ml；对照组浇等量的蒸馏水，两天后，将对照组三株分别取真叶标记为ck1、ck2、ck3，同样将实验组3株分别取真叶标记为salt1、salt2、slat3，最后将6个样进行干冰冷冻然后送北京组学生物公司分别提取rna进行转录组测序、提取蛋白进行蛋白组测序。
38.通过对转录组与蛋白组的联合分析，一共得到了24个共性的差异表达基因，这24个基因在转录组与蛋白组结果中均显著差异表达。通过对目的基因的注释与比对，盐胁迫前后表达量差异倍数比对，并且对基因功能进行总结，得到两个显著差异表达的基因gh_d10g0907与gh_d11g0978，且在其他物种中发现有明显耐盐性。gh_d10g0907作为甘油葡萄糖苷磷酸合成酶将甘油-3-磷酸和adp-葡萄糖经甘油葡萄糖苷磷酸合成酶(ggps)合成甘油葡萄糖磷酸，在藻类与微生物中是一种已知的耐盐基因。gh_d11g0978基因是一类胚胎发育相关(lea)的基因，同时也参与调节渗透，是已知的一类抗胁迫基因，在多种农作物中都有发现有耐盐耐旱耐寒的作用，比如玉米小麦等作物。于是将两个基因确定作为目的基因，并对其耐盐功能进行验证。
39.步骤2、耐盐基因的表达模式验证
40.步骤2.1、对于上述耐盐候选基因，利用primer5进行引物的设计并合成，将rna反转录为cdna，利用实时定量pcr进行表达模式验证；
41.步骤2.2、在棉花中开展候选基因的基因克隆与基于病毒介导沉默(virus-induced gene silencing，vigs)的功能验证。gh_d10g0907全长1119bp编码氨基酸372个，属于ggps家族。gh_d11g0978全长456bp编码氨基酸151个，属于lea家族。这两个家族在不同的物种中均有耐盐性相关验证。用vigs技术获得了gh_d10g0907和gh_d11g0978的基因沉默植株，对沉默植株进行盐处理后，沉默植株出现早枯萎与较大程度的盐害表型。而且沉默植株对比对照组活性氧含量更高。因此认为这两个基因在陆地棉盐胁迫下有着重要的作用。
42.通过对转录组与蛋白组的联合分析，一共得到了24个共性的差异表达基因，这24个基因在转录组与蛋白组结果中均显著差异表达。将这24个基因作为研究陆地棉盐胁迫下响应机制的候选基因。通过对目的基因的注释与比对，盐胁迫前后表达量差异倍数比对，并且对基因功能进行总结，得到两个显著差异表达的基因gh_d10g0907与gh_d11g0978，且在其他物种中发现有明显耐盐性。gh_d10g0907作为甘油葡萄糖苷磷酸合成酶将甘油-3-磷酸和adp-葡萄糖经甘油葡萄糖苷磷酸合成酶(ggps)合成甘油葡萄糖磷酸，在藻类与微生物中是一种已知的耐盐基因。gh_d11g0978基因是一类胚胎发育相关(lea)的基因，同时也参与调节渗透，是已知的一类抗胁迫基因，在多种农作物中都有发现有耐盐耐旱耐寒的作用，比如玉米小麦等作物。于是将两个基因确定作为目的基因，并对其耐盐功能进行验证。这两个基因经过rt-qpcr表达分析(图1)和vigs功能验证(图2)，表明其过表达能提高耐盐性。
43.综上所述，根据本发明获得的棉花耐盐基因gh_d10g0907和gh_d11g0978分别位于棉花d10和d11号染色体。该基因可通过分子辅助育种转移到农艺性状优良的棉花材料，进而创制耐盐且农艺性状优良的棉花材料或品种。
44.本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏
离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。