一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法

本发明涉及了一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，具体地说涉及枯草芽孢杆菌的叠氮化修饰糖胺聚糖骨架合成途径的改造及基于该菌株的针对糖胺聚糖骨架合酶的荧光激活细胞分选，属于生物技术。

背景技术：

1、糖胺聚糖(glycosaminoglycan，gags)是广泛存在于高等动物结缔组织中的一种长线形杂多糖，由己糖醛酸或己糖、己糖胺的重复二糖单元组成，根据单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置，可将糖胺聚糖可分为：透明质酸(hyaluronic acid，ha)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate，cs)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate，ds)、硫酸角质素(keratin sulfate，ks)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，hs)和肝素(heparin，hp)。糖胺聚糖可与生长因子、细胞因子、趋化因子和酶相互作用，对机体生长、炎症反应、凝血、肿瘤转移等过程具有重要的影响。

2、尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶(uridine diphosphate glucose-6-dehydrogenase，tuad)，该酶存在于枯草芽孢杆菌基因组dna中，可催化尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucose)转化为尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(udp-glca)，在已有的研究中已经证明了udp-glca对糖胺聚糖骨架生物合成有限制，因此tuad是高水平糖胺聚糖骨架生物合成的关键。

3、糖胺聚糖骨架合酶(glycosyltransferase，gts)是催化单糖单元以区域和立体定向的方式从糖供体转移到多糖上的一种酶，为合成复杂低聚糖提供了非常高效的方法。然而，可利用的gts数量有限，加之其不稳定性和严格的底物特异性，严重阻碍了这些酶的广泛应用，因此，获得可以高效合成特定低聚糖和糖缀合物的糖基转移酶具有深刻的意义。

4、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，属于革兰氏阳性菌，被认为是gras(generally recognized as safe)，对环境具有很好的耐受性，且根据已有的研究，枯草芽孢杆菌关于糖胺聚糖合成途径的相关背景较为干净。

5、在过去的研究中，通过蛋白质工程定向进化的方法在拓宽底物范围、改变底物特异性和提高gts活性等方面取得了有限的成功，部分原因是缺乏有效的高通量筛选方法。由于与糖苷键形成相关的荧光或吸光度没有明显变化，因此测定gts活性极具挑战性。而理想表型的筛选在大多数情况下是一个随机过程。因此，开发可应用于大型gts文库的高通量、低成本的筛选方法是非常有意义的。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法。具体是构建一株高效合成叠氮化修饰糖胺聚糖骨架的重组枯草芽孢杆菌，再通过该菌株对糖胺聚糖骨架合酶进行高通量筛选。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种糖胺聚糖骨架合酶的高通量筛选方法，包括步骤如下：

4、(1)采用blastp方法，随机获取糖胺聚糖骨架合酶基因，构建糖胺聚糖骨架合酶文库；

5、(2)分别将文库中的糖胺聚糖骨架合酶基因和尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶基因tuad表达盒连接到phcmc04质粒中，得到重组载体phcmc04-gts-tuad；

6、(3)将重组载体phcmc04-gts-tuad转化到枯草芽孢杆菌bs168ass中，挑选阳性重组子，得到筛选糖胺聚糖骨架合酶的重组菌gd；

7、(4)将筛选糖胺聚糖骨架合酶的重组菌gd按照0.05～0.15％的体积比接种于含特殊底物的lb液体培养基中，在35～40℃，200～250rpm下过夜培养，得到重组菌gd的菌液；

8、(5)将重组菌gd的菌液按照0.5～1.5％的体积比接种于含特殊底物的lb液体培养基中，培养至od600为0.6～0.8，然后转移至不含葡萄糖的m9低盐培养基中，培养0.5～1.5h，加入终浓度为15～25g/l的木糖诱导剂和终浓度为80～120μg/ml的n-叠氮乙酰葡萄糖胺，诱导培养4～8h，然后将菌体与荧光素避光反应0.5～1.5h，当糖胺聚糖骨架合酶文库中的基因在20个以下时，将荧光反应后的菌体进行流式分析，再测定荧光强度或测定荧光强度与吸光度的比值，筛选出目标糖胺聚糖骨架合酶；当糖胺聚糖骨架合酶文库中的基因超过20个时，将荧光反应后的菌体进行流式分选，再测定荧光强度，收集荧光强度在前0.5～2％的菌体，筛选出目标糖胺聚糖骨架合酶。

9、根据本发明优选的，步骤(1)中，所述糖胺聚糖骨架合酶为硫酸软骨素骨架合酶、肝素骨架合酶或透明质酸合酶。

10、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶基因tuad的ncbi数据库的id为936766。

11、根据本发明优选的，步骤(3)中，所述枯草芽孢杆菌bs168ass为阻断内源尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖苷(glcnac)合成途径，表达异源尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖苷补救合成途径的枯草芽孢杆菌。

12、根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌bs168ass的构建方法如下：

13、以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis subsp.subtilis str.168为出发菌株，敲除编码合成udp-glcnac途径的关键酶分子的基因glms，然后插入编码n-乙酰己糖胺-1-激酶的基因nahk和编码n-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸-尿嘧啶转移酶的基因agx1，得到枯草芽孢杆菌bs168ass。基因glms编码的酶负责催化果糖-6-磷酸到葡萄糖-6-磷酸，基因nahk编码的酶可以利用atp和glcnac催化得到glcnac-1-p，基因agx1编码的酶可以催化glcnac-1-p到udp-glcnac，枯草芽孢杆菌bs168ass可以利用n-叠氮乙酰化葡萄糖胺glcnaz为底物生成udp-glcnaz。

14、进一步优选的，所述基因glms的ncbi数据库的id为938736，所述n-乙酰己糖胺-1-激酶的基因nahk来自于长双歧杆菌，ncbi数据库的id为69578838，所述n-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸-尿嘧啶转移酶的基因agx1来自于人，ncbi数据库的id为6675。

15、根据本发明优选的，步骤(4)和(5)中，所述含特殊底物的lb液体培养基的组分如下：10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、20g/l氯化钠、5μg/ml氯霉素和100μg/ml糖胺聚糖骨架合酶天然底物glcnac。

16、根据本发明优选的，步骤(5)中，所述荧光素为cyanine5 dbco，荧光素的终浓度为0.5mm，避光反应时间为1h。

17、根据本发明优选的，步骤(5)中，所述测定荧光强度和吸光度的具体参数为：发射波长为646nm，激发波长为662nm，吸光度为600nm。

18、本发明的技术特点：

19、本发明利用glcnaz培养含糖胺聚糖骨架合酶的重组菌bs168assgd，使菌株表面产生叠氮化修饰的糖胺聚糖骨架，该多糖骨架与荧光染料cyanine5 dbco发生点击化学反应后使菌株表面带有荧光，含有糖胺聚糖骨架合酶菌株的荧光强度与吸光度的比值是不含糖胺聚糖骨架合酶的菌株的1倍以上，结合荧光激活细胞分选可以实现对有活性的糖胺聚糖骨架合酶进行高通量筛选。

20、荧光染料cyanine5 dbco与glcnaz发生点击化学反应的反应式如下：

21、

22、有益效果：

23、本发明以阻断内源glcnac合成途径，表达glcnac(glcnaz)补救合成途径的枯草芽孢杆菌bs168ass为宿主菌，过表达了尿苷二磷酸-葡萄糖-6-脱氢酶基因tuad和糖胺聚糖骨架合酶基因，构建了筛选糖胺聚糖骨架合酶的重组菌。然后以该菌株为基准，通过测定荧光强度或测定荧光强度与吸光度的比值，实现对有活性的糖胺聚糖骨架合酶菌株进行高通量且准确的筛选，极大的提高了筛选效率，且对于新来源的酶，特别是宏基因组文库中无法培养的微生物群中新糖胺聚糖骨架合酶的发现提供了新的起点。