异体共生年轻化因子及其在延缓机体衰老中的应用

本发明属于生物，具体涉及异体共生年轻化因子在多组织细胞和分子水平上延缓机体衰老中的应用。

背景技术：

1、衰老是一种涉及全身多种组织器官的系统性退化过程，导致再生能力减弱、组织和器官功能下降。目前已经有多种方式被报道可以延缓衰老相关表型。其中，异时异体共生(heterochronic parabiosis，hp)是近年来受到广泛关注的一种研究模型体系。在hp小鼠模型中，年老和年轻小鼠的循环系统通过手术连接起来，构建了一个共享的循环系统，其中双方产生的血源性因子与另一个个体共享。因此，hp提供了一个独特的实验范式，用来研究一个完整的衰老有机体如何通过“促年轻化因子”(“pro-youth factors”)的注入而恢复活力。反之亦然，年轻的机体又如何受到循环系统的“促衰老因子”(“pro-aging factors”)的影响。到目前为止，我们对血源性因子的细胞靶点以及它们如何在系统水平上促进衰老个体年轻化的了解仍然有限。

2、另一方面，系统性衰老的许多特征都与器官特异性成体干细胞的损伤和耗竭存在关联。例如，在发育完全的器官和组织，如骨髓、皮肤、大脑和骨骼肌中，数量不多的成体干细胞群体能在整个生命过程中补充组织，以修复与年龄相关的损伤并维持组织稳态。在由多个器官和组织(包括骨髓、脾脏、外周血和造血干细胞及其直系子代)组成的造血和免疫系统中，造血干祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,hspcs)能产生各种免疫细胞类型。然而，随着年龄的增长，造血干祖细胞逐渐失去了维持免疫细胞组成的能力，并表现为髓系偏移的分化潜能，导致年龄相关的造血功能障碍和免疫力低下。类似地，其他器官和组织中，如皮肤、骨骼肌和大脑，也驻留不同类型的成体干细胞，即负责毛囊和表皮的再生的毛囊干细胞(hfscs)和基底细胞、纤维/脂肪生成祖细胞(faps)和骨骼肌的卫星细胞以及大脑神经干细胞。这些成体干细胞随着年龄的增长逐渐失去再生能力，导致脱发和皮肤老化、骨骼肌和神经退化。因此，造血系统和外周器官中的常驻成体干细胞都受到衰老的危害，但它们是否以及在多大程度上可以恢复活力还需要进一步研究。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是如何延缓衰老。

2、为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种应用，所述应用可为下述a1)-a10)中任一种：

3、a1)、蛋白ccl3或蛋白yy1或蛋白gilz或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1或所述蛋白gilz编码基因表达的物质或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1或所述蛋白gilz活性或含量的物质在调控机体和/或细胞和/或组织衰老水平中的应用；

4、a2)、蛋白ccl3或蛋白yy1或蛋白gilz或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1或所述蛋白gilz编码基因表达的物质或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1或所述蛋白gilz活性或含量的物质在制备机体和/或细胞和/或组织衰老水平的产品中的应用；

5、a3)、蛋白ccl3或蛋白yy1或蛋白gilz或测定蛋白ccl3或蛋白yy1或蛋白gilz含量的物质在鉴定或辅助鉴定机体和/或细胞和/或组织衰老水平中的应用；

6、a4)、蛋白ccl3或蛋白yy1或蛋白gilz或测定蛋白ccl3或蛋白yy1或蛋白gilz含量的物质在制备鉴定或辅助鉴定机体和/或细胞和/或组织衰老水平的产品中的应用；

7、a5)、蛋白ccl3或蛋白yy1或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1编码基因表达的物质或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1活性或含量的物质在调控造血干(祖)细胞的重建能力中的应用；

8、a6)、蛋白ccl3或蛋白yy1或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1编码基因表达的物质或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1活性或含量的物质在制备调控造血干(祖)细胞的重建能力的产品中的应用；

9、a7)、蛋白ccl3或蛋白yy1或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1编码基因表达的物质或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1活性或含量的物质在调控造血干(祖)细胞的谱系分化的应用；

10、a8)、蛋白ccl3或蛋白yy1或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1编码基因表达的物质或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1活性或含量的物质在制备调控造血干(祖)细胞的谱系分化的产品中的应用；

11、a9)、蛋白gilz或调控所述蛋白gilz编码基因表达的物质或调控所述蛋白gilz活性或含量的物质在调控皮肤成纤维细胞的增殖能力中的应用；

12、a10)、蛋白gilz或调控所述蛋白gilz编码基因表达的物质或调控所述蛋白gilz活性或含量的物质在制备调控皮肤成纤维细胞的增殖能力的产品中的应用。

13、上文中，所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1或所述蛋白gilz可为天然的蛋白，如来源于哺乳动物的蛋白，也可为非天然的蛋白，如重组蛋白等，所述重组蛋白只要具有天然的蛋白的功能即可。

14、所述ccl3蛋白可为人ccl3蛋白或小鼠ccl3蛋白。所述人ccl3蛋白的氨基酸序列的genbank号为np_002974.1，所述小鼠ccl3蛋白的氨基酸序列的genbank号为np_035467.1。

15、所述yy1蛋白可为人yy1蛋白或小鼠yy1蛋白。所述人yy1蛋白的氨基酸序列的genbank号为np_003394.1，所述小鼠yy1蛋白的氨基酸序列的genbank号为np_033563.2。

16、所述gilz蛋白可为人gilz蛋白或小鼠gilz蛋白。所述人gilz蛋白的genbank号为：np_001015881.1，所述小鼠gilz蛋白的genbank号为：np_001070832.1。

17、进一步地，上述的应用中，所述调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1编码基因表达的物质或调控所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1蛋白活性或含量的物质可为生物材料b1，所述生物材料b1可为下述b11)至b17)中的任一种：

18、b11)、编码所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1的核酸分子；

19、b12)、含有b11)所述核酸分子的表达盒；

20、b13)、含有b11)所述核酸分子的重组载体、或含有b12)所述表达盒的重组载体；

21、b14)、含有b11)所述核酸分子的重组微生物、或含有b12)所述表达盒的重组微生物、或含有b13)所述重组载体的重组微生物；

22、b15)、含有b11)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有b12)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有b13)所述重组载体的转基因动物细胞系；

23、b16)、含有b11)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有b12)所述表达盒的转基因动物组织、或含有b13)所述重组载体的转基因动物组织；

24、b17)、含有b11)所述核酸分子的转基因动物器官、或含有b12)所述表达盒的转基因动物器官、或含有b13)所述重组载体的转基因动物器官。

25、进一步地，上述的应用中，b11)所述核酸分子可为所述蛋白ccl3或所述蛋白yy1蛋白的编码基因，所述蛋白ccl3的编码基因为ccl3基因或ccl3基因的编码序列；所述蛋白yy1的编码基因为yy1基因或yy1基因的编码序列。

26、所述ccl3基因可为人ccl3基因或小鼠ccl3基因。所述人ccl3基因的genbank号为nm_002983.3，其编码序列为核苷酸序列是nm_002983.3的第86-364位所示的dna分子；所述小鼠ccl3基因的genbank号为nm_011337.2，其编码序列为核苷酸序列是nm_011337.2的第102-380位所示的dna分子。

27、所述yy1基因可为人yy1基因或小鼠yy1基因。所述人yy1基因的genbank号为nm_003403.5，其编码序列是核苷酸序列是nm_003403.5第102-1346位所示的dna分子。所述小鼠yy1基因的genbank号为nm_009537.4，其编码序列为核苷酸序列是nm_009537.4第117-1361位所示的dna分子。

28、进一步地，上述的应用中，所述调控所述蛋白gilz编码基因表达的物质或调控所述蛋白gilz活性或含量的物质可为生物材料b2，所述生物材料b2可为抑制或降低所述蛋白gilz的编码基因的表达的rna分子或抑制或降低所述蛋白gilz的活性或含量的rna分子；

29、进一步地，上述的应用中，b21)所述抑制或降低所述蛋白gilz的编码基因的表达的rna分子或抑制或降低所述蛋白gilz的活性或含量的rna分子可为下述i1)或i2)或i3)：

30、i1)、rna分子的靶标序列为蛋白gilz的编码基因；

31、i2)、rna分子的靶标序列的核苷酸序列是seq id no.1；

32、i3)、rna分子的靶标序列的核苷酸序列是seq id no.2。

33、所述gilz蛋白可为人gilz蛋白或小鼠gilz蛋白。所述人gilz蛋白可为人gilz基因编码的蛋白质，所述人gilz基因的genbank号为xm_005262103.5，其编码序列为核苷酸序列是xm_005262103.5的第160-762位所示的dna分子，所述人gilz蛋白的genbank号为np_001015881.1。所述小鼠gilz蛋白可为小鼠gilz基因编码的蛋白质，所述小鼠gilz基因的genbank号为nm_001077364.1，其编码序列为核苷酸序列是nm_001077364.1第204-809位所示的dna分子，所述小鼠gilz蛋白的genbank号为np_001070832.1。

34、为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供异体共生动物在如下p1)-p18)中任一种中的应用：

35、p1)、降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或大脑组织中衰老细胞比例；

36、p2)、降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或骨骼肌组织中细胞凋亡比例；

37、p3)、减轻肝脏组织炎症面积；

38、p4)、减轻肝脏组织和/或脾脏组织纤维化面积；

39、p5)、增加骨骼肌组织肌纤维直径；

40、p6)、增加皮肤组织毛囊数量；

41、p7)、增加骨髓中pro-b细胞比例；

42、p8)、增加造血干祖细胞中ccl3蛋白或/和yy1蛋白表达水平；

43、p9)、上调ccl3基因或/和yy1基因表达水平。

44、p10)通过降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或大脑组织中衰老细胞比例延缓衰老；

45、p11)通过降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或骨骼肌组织中细胞凋亡比例延缓衰老；

46、p12)通过降低肝脏组织炎症面积延缓衰老；

47、p13)通过降低肝脏组织和/或脾脏组织纤维化面积延缓衰老；

48、p14)通过降低骨骼肌组织肌纤维直径延缓衰老；

49、p15)通过降低皮肤组织毛囊数量延缓衰老；

50、p16)通过增加骨髓中pro-b细胞比例延缓衰老；

51、p17)通过增加造血干祖细胞中ccl3蛋白或/和yy1蛋白表达水平延缓衰老；

52、p18)通过上调ccl3基因或/和yy1基因表达水平延缓衰老；

53、为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供构建重组细胞的方法，所述方法包括向受体细胞中导入目的蛋白的编码基因，促进或提高或上调所述目的蛋白的编码基因表达，或促进或提高或上调所述目的蛋白的活性或含量，得到衰老水平低于所述受体细胞的重组细胞；

54、所述目的蛋白为权利要求1中所述ccl3蛋白或权利要求1中所述yy1蛋白。

55、为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供由上述的方法构建得到的重组细胞。

56、本发明中，所述重组细胞可为重组哺乳动物细胞。

57、所述哺乳动物可为人，也可为非人哺乳动物。

58、为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供上述重组细胞系在下述d1)或d2)中的应用：

59、d1)、在提高年老造血干细胞的重建能力中的应用；

60、d2)、在制备提高年老造血干细胞的重建能力的产品中的应用。

61、本发明所提供的的应用或方法可以是疾病的诊断和治疗的目的，也可以是非疾病的诊断和治疗的目的。

62、为解决上述技术问题，第六个方面，本发明提供上述的蛋白ccl3或蛋白yy1或蛋白gilz，或上述的生物材料b1或/和生物材料b2。

63、在本发明的一个实施例中，通过评估造血干(祖)细胞的重建能力来评估机体和/或细胞和/或组织衰老水平。

64、在本发明的一个实施例中，通过竞争移植性实验评估造血干(祖)细胞的重建能力。

65、在本发明的一个实施例中，所述提高造血干(祖)细胞的重建能力具体表现为：在竞争性移植实验中，过表达蛋白ccl3的年老小鼠供体来源的t细胞占比显著(p＜0.05)高于对照组；过表达yy1的年老小鼠供体来源的整体细胞、t细胞、myeloid细胞的占比显著(p＜0.05)高于对照组。

66、在本发明的一个实施例中，通过评估成纤维细胞的增殖能力来评估机体和/或细胞和/或组织衰老水平。

67、在本发明的一个实施例中，通过ki67染色实验和凋亡细胞占比来评估成纤维细胞的增殖能力。

68、在本发明的一个实施例中，所述转基因细胞系降低成纤维细胞的增殖能力具体表现为：gilz基因的rna干扰组(si-gilz)的人成纤维细胞和小鼠成纤维细胞中，被ki67染色的细胞数目显著低于对照组(si-nc)，表明rna干扰组(si-gilz)的细胞增殖能力降低；并且rna干扰组(si-gilz)的人成纤维细胞和小鼠成纤维细胞中，凋亡细胞的比例(7.81％、7.89％)显著低于对照组(11.80、12.20)，表明rna干扰组(si-gilz)的细胞凋亡水平升高。

69、在本发明的一个实施例中，所述异体共生动物为异体共生小鼠模型。

70、在本发明的一个实施例中，所述小鼠异体共生模型的制备方法是：将2只小鼠中的每只从肘部、侧腹和要连接一侧的膝盖沿连续线剃毛。用碘消毒+70％酒精皮肤擦洗超过3个交替循环，为切口做准备。使用高压灭菌仪器并保持无菌区域。在每只小鼠上，用剪刀沿侧腹切开皮肤，从膝盖近端到肘部近端，不带扰乱皮下的肌肉。用2条间断缝合线连接动物的三头肌。沿着侧翼连接体壁，连续缝合7-9遍。用2条间断缝合线连接动物的股四头肌。用间断缝合缝合2个个体的皮肤。然后将小鼠以仰卧姿势放置在加热垫上，并让其在环境空气中醒来。在抛物手术后，每一对分别接受单独的饲养，每天皮下注射0.25％布比卡因1ml生理盐水，持续3天。

71、在本发明的一个实施例中，所述降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或大脑组织中衰老细胞比例体现在减少脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或大脑组织中sa-β-gal染色阳性区域。

72、所述减轻肝脏组织炎症体现在减少肝脏组织中he染色炎症细胞浸润面积。

73、所述降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或骨骼肌组织中细胞凋亡体现在tunel染色中阳性细胞比例。

74、所述减轻肝脏组织和/或脾脏组织纤维化体现在马松染色中阳性面积。

75、所述增加骨骼肌组织肌纤维直径体现在he染色中肌纤维面积的测量。

76、所述增加皮肤组织毛囊数量体现在he染色中毛囊数量的变化。

77、上述应用中，所述延缓造血干祖细胞衰老体现在增强年老造血干(祖)细胞的重建能力和/或谱系分化的能力；

78、所述yy1和/或ccl3表达水平均为蛋白表达水平。

79、所述yy1和/或ccl3表达水平均为基因表达水平。

80、上述应用中，所述外周血、所述骨髓、所述脾脏组织、所述脑组织、所述肝脏组织、所述骨骼肌组织和所述皮肤组织为哺乳动物外周血、骨髓、脾脏组织、脑组织、肝脏组织、骨骼肌组织和皮肤组织，所述哺乳动物包括人类。

81、本发明中系统地分析了取样自异时异体共生和同时异体共生(isochronicparabiosis)小鼠(mus musculus)的造血和免疫系统(造血干祖细胞、骨髓、外周血和脾脏)以及受造血和免疫器官影响的四个实体组织/器官(皮肤、骨骼肌、大脑和肝脏)的单细胞转录组。通过这一方法，本发明能够构建一个多组织单细胞转录组图谱来研究hp对衰老的影响，并探索成体干细胞及其微环境的复杂变化和调控作用。本发明分析了年轻的循环系统环境如何使年老的个体恢复活力，以及年老的循环系统环境如何损害年轻的个体，从而改变细胞类群、基因表达特征和细胞-细胞间通信。在我们的异体共生图谱中，本发明发现造血干祖细胞是在造血和免疫系统中对互相浸润最为抵抗，同时对系统调节最敏感的细胞类型之一。此外，本发明还发现了具有逆转衰老相关损伤潜力的调控因子。本研究可以促进我们对衰老相关系统性变化的理解，以及发展新型衰老干预策略。