红细胞模拟物、其制备方法及质控物或校准物与流程

1.本发明涉及血液细胞分析领域，特别涉及一种红细胞模拟物、其制备方法及质控物或校准物。


背景技术：

2.红细胞是人血液中的重要组成成分，红细胞的数量和形态相关参数是血液常规筛查的重要参数。血液细胞分析仪器对外周全血进行分析可以获得红细胞的参数信息，为了有效的对仪器的红细胞相关结果输出进行监控和校准，需要制备能够有效模拟红细胞特征的红细胞模拟物。
3.现有血细胞分析仪用质控物、校准物中红细胞模拟粒子基本上是使用人红细胞或动物红细胞进行制作，但是目前技术存在一定缺陷：（1）使用人源性的红细胞进行制作，在国内应用条件存在限制，如法律法规禁止血液买卖和非临床使用，因此使用人源性的红细胞制备血细胞分析仪用质控物、校准物的红细胞模拟粒子无法商品化使用，原材料也无法获取并且无法规模化生产，使用该方式制作的基本上是国外的一些厂商；（2）使用动物红细胞进行模拟，由于动物红细胞的大小与人类红细胞的大小存在很大差异，直接使用动物红细胞来制作血细胞分析仪用质控物、校准物不能够准确反应人红细胞在仪器上的运行状态，使得仪器的质控校准的准确性存在一定的缺陷。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提出一种红细胞模拟物的制备方法。
5.本发明还提出一种采用上述制备方法所制备出的红细胞模拟物。
6.本发明还提出一种含有上述红细胞模拟物的血液细胞分析质控物或校准物。
7.本发明提供一种红细胞模拟物的制备方法，包括以下步骤：（1）取哺乳动物血液，去除血液样本中的白细胞及血小板，得到纯化的动物红细胞悬浮液，使用洗涤液将所述纯化的动物红细胞悬浮液调整至第一预设浓度；（2）使用强化剂与步骤（1）处理后的红细胞悬浮液按第一预设比例进行混合，对混合后的混合液进行水浴、离心、超声处理，使用洗涤液将处理后的红细胞悬浮液调整至第二预设浓度；（3）使用膨胀剂与步骤（2）处理后的红细胞悬浮液按第二预设比例进行混合，经生化培养箱培养处理，使用洗涤液将处理后的红细胞悬浮液调整至第三预设浓度；（4）使用稳定剂与步骤（3）处理后的红细胞悬浮液按第三预设比例进行混合，经生化培养箱培养处理，使用洗涤液洗涤后用保存液进行保存，得到红细胞模拟物；其中，上述步骤中的所述强化剂主要组成为醛类、防腐剂、无机盐中的一种或多种；所述膨胀剂主要组成为无机盐、氟化物中的一种或多种；所述稳定剂主要组成为醛类、生物碱、重金属盐、无机盐、防腐剂中的一种或多种；所述保存液主要组成为缓冲剂、糖类、防腐剂、分散剂中的一种或多种。
8.在一实施例中，所述哺乳动物为牛、猪、马、狗、兔、豚鼠或大鼠。
9.在一实施例中，所述第一预设比例为1：1。
10.在一实施例中，所述第二预设比例为4：1或2：1。
11.在一实施例中，所述第三预设比例为3：2或4：1。
12.在一实施例中，所述步骤（3）中，所述生化培养箱的培养参数设置为温度2℃~60℃，时间0.5h~72h。
13.在一实施例中，所述步骤（4）中，所述生化培养箱的培养参数设置为温度2℃~60℃，时间5min~480min。
14.在一实施例中，所述强化剂包含：多聚甲醛0.01g~10g，氯化钠0.1g~50g，苯甲醇0.1g~100g及纯化水定容至1l；所述洗涤液包含：氯化钠9g及纯化水定容至1l；所述膨胀剂包含：氯化钠0.1g~50g，磷酸二氢钾0.1g~10g，十二水合磷酸氢二钠0.1g~10g，氯化钾0.1g~10g及纯化水定容至1l；所述稳定剂包含：戊二醛0.01g~10g，醋酸铅0.1g~10g，马齿苋生物碱0.1g~10g，氯化钠0.1g~50g，pc1500.1g~10g及纯化水定容至1l。
15.在一实施例中，所述强化剂包含：戊二醛0.01g~10g，氯化钠0.1g~50g，pc3000.1g~10g及纯化水定容至1l；所述洗涤液包含：氯化钠9g及纯化水定容至1l；所述膨胀剂包含：氟化钠0.1g~50g，磷酸二氢钾0.1g~10g，十二水合磷酸氢二钠0.1g~10g，氯化钾0.1g~10g及纯化水定容至1l；所述稳定剂包含：甲醛0.01g~10g，硫酸铜0.1g~10g，莲心碱0.1g~10g，氯化钠0.1g~50g，pc300 0.1g~10g及纯化水定容至1l。
16.在一实施例中，所述醛类主要组成为甲醛、多聚甲醛、乙醛、戊二醛中的一种或多种；所述生物碱主要组成为马齿苋生物碱、山莨菪碱、莲心碱中的一种或多种；所述重金属盐主要组成为醋酸铅、硫酸铜、氯化汞、硝酸银中的一种或多种；所述缓冲剂主要组成为磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐中的一种或多种；所述糖类主要组成为葡萄糖、麦芽糖、果糖中的一种或多种；所述防腐剂主要组成为苯甲醇、苯甲酸、pc300、硫柳汞、青霉素、链霉素中的一种或多种；所述分散剂主要组成为edta、聚乙二醇、柠檬酸钠中的一种或多种；所述无机盐主要组成为氯化钠、氯化钾中的一种或多种。
17.本发明还提供一种红细胞模拟物，所述红细胞模拟物由上述制备方法制得。
18.本发明还提供一种血液细胞分析质控物或校准物，包含按照上述制备方法制得的红细胞模拟物。
19.综上所述，本发明提供一种红细胞模拟物、其制备方法及质控物或校准物，采用该制备方法可以使动物血液红细胞与人类血液红细胞具有类似的性质，且性能稳定，可用于制备血细胞分析用质控物和校准物的红细胞模拟物，使用该红细胞模拟物能够准确反映人红细胞在仪器上的运行状态，提升仪器质控校准的准确性。
20.动物血液红细胞通过试剂处理，可改变动物血液红细胞的大小，使动物红细胞的大小范围与人类红细胞的大小范围达到一致，并且可以增强动物红细胞的稳定性，可以用来监测血细胞分析仪中红细胞的相关参数。先对动物血液进行纯化，去除血液中的白细胞及血小板，得到纯化的动物红细胞悬浮液，使用稀释液将红细胞稀释至一定浓度，使用强化剂增强细胞膜的强度，从而降低红细胞的脆性，然后对红细胞进行超声处理，通过离心等方式将细胞脆性较大的红细胞进行去除，保留细胞脆性较小的红细胞，使用膨胀剂对细胞进行处理，改变红细胞的大小使其接近人红细胞大小，最后使用稳定剂对细胞进行处理，增加
红细胞的稳定性，以便红细胞模拟物的长期保存。
附图说明
21.图1为本发明实施例一中对红细胞模拟物的监测数据曲线图。
22.图2为本发明实施例二中对红细胞模拟物的监测数据曲线图。
具体实施方式
23.下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
24.本发明提供一种红细胞模拟物、其制备方法及质控物或校准物，该红细胞模拟物的制备方法包括以下步骤：（1）取哺乳动物血液，去除血液样本中的白细胞及血小板，得到纯化的动物红细胞悬浮液，使用洗涤液将所述纯化的动物红细胞悬浮液调整至第一预设浓度。
25.示例性的，可以通过过滤以及离心的方式去除血液样本中的白细胞及血小板；或可以通过过滤以及洗涤的方式去除血液样本中的白细胞及血小板；或可以通过过滤、离心以及洗涤的方式去除血液样本中的白细胞及血小板，得到纯化的动物红细胞悬浮液。
26.（2）使用强化剂与步骤（1）处理后的红细胞悬浮液按第一预设比例进行混合，对混合后的混合液进行水浴、离心、超声处理，使用洗涤液将处理后的红细胞悬浮液调整至第二预设浓度。其中，强化剂可增强细胞膜的强度，从而降低红细胞的脆性，对红细胞进行超声处理，通过离心等方式可将细胞脆性较大的红细胞进行去除，保留细胞脆性较小的红细胞。
27.（3）使用膨胀剂与步骤（2）处理后的红细胞悬浮液按第二预设比例进行混合，经生化培养箱培养处理，使用洗涤液将处理后的红细胞悬浮液调整至第三预设浓度。其中，使用膨胀剂对红细胞进行处理，可改变红细胞的大小并使其接近人红细胞大小，使得动物红细胞的大小范围与人类红细胞的大小范围达到一致。
28.（4）使用稳定剂与步骤（3）处理后的红细胞悬浮液按一定比例进行混合，经生化培养箱培养处理，使用洗涤液洗涤后用保存液进行保存，得到类似于人血液红细胞性质的红细胞模拟物。使用稳定剂对红细胞进行处理，可增加红细胞的稳定性，以便于红细胞模拟物的长期保存，延长使用寿命。
29.其中，上述步骤中的所述强化剂主要组成为醛类、防腐剂、无机盐中的一种或多种；所述膨胀剂主要组成为无机盐、氟化物中的一种或多种；所述稳定剂主要组成为醛类、生物碱、重金属盐、无机盐、防腐剂中的一种或多种；所述保存液主要组成为缓冲剂、糖类、防腐剂、分散剂中的一种或多种。
30.进一步地，上述步骤中，所述醛类主要组成为甲醛、多聚甲醛、乙醛、戊二醛中的一种或多种；所述生物碱主要组成为马齿苋生物碱、山莨菪碱、莲心碱中的一种或多种；所述重金属盐主要组成为醋酸铅、硫酸铜、氯化汞、硝酸银中的一种或多种；所述缓冲剂主要组成为磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐中的一种或多种；所述糖类主要组成为葡萄糖、麦芽糖、果糖中的一种或多种；所述防腐剂主要组成为苯甲醇、苯甲酸、pc300、硫柳汞、青霉素、链霉素中的一种或多种；所述分散剂主要组成为edta、聚乙二醇、柠檬酸钠中的一种或多种；所述无机盐主要组成为氯化钠、氯化钾中的一种或多种。
31.哺乳动物可选用牛、猪、马、狗、兔、豚鼠或大鼠等。
32.可选地，上述步骤（3）中，所述生化培养箱的培养参数设置为温度2℃~60℃，时间0.5h~72h。
33.优选地，所述生化培养箱的培养参数设置为温度为25℃，时间为48h。
34.优选地，所述生化培养箱的培养参数设置为温度为20℃，时间为24h。
35.可选地，上述步骤（4）中，所述生化培养箱的培养参数设置为温度2℃~60℃，时间5min~480min。
36.优选地，所述生化培养箱的培养参数设置为温度37℃，时间60min。
37.优选地，所述生化培养箱的培养参数设置为温度37℃，时间120min。
38.可选地，上述步骤（2）中，所述水浴的参数设置为温度2℃~60℃，时间5min~480min。
39.优选地，所述水浴的参数设置为温度30℃，时间30min。
40.可选地，上述步骤（2）中，所述超声的功率范围为10~40khz。
41.优选地，所述超声的功率为10khz。
42.可选地，所述强化剂包含：多聚甲醛0.01g~10g，氯化钠0.1g~50g，苯甲醇0.1g~100g及纯化水定容至1l；所述洗涤液包含：氯化钠9g及纯化水定容至1l；所述膨胀剂包含：氯化钠0.1g~50g，磷酸二氢钾0.1g~10g，十二水合磷酸氢二钠0.1g~10g，氯化钾0.1g~10g及纯化水定容至1l；所述稳定剂包含：戊二醛0.01g~10g，醋酸铅0.1g~10g，马齿苋生物碱0.1g~10g，氯化钠0.1g~50g，pc1500.1g~10g及纯化水定容至1l。
43.优选地，所述强化剂包含：多聚甲醛0.5g，氯化钠8.5g，苯甲醇30g及纯化水定容至1l；所述洗涤液包含：氯化钠9g及纯化水定容至1l；所述膨胀剂包含：氯化钠4g，磷酸二氢钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g及纯化水定容至1l；所述稳定剂包含：戊二醛0.05g，醋酸铅2g，马齿苋生物碱6g，氯化钠8.5g，pc1501g及纯化水定容至1l。
44.可选地，所述强化剂包含：戊二醛0.01g~10g，氯化钠0.1g~50g，pc3000.1g~10g及纯化水定容至1l；所述洗涤液包含：氯化钠9g及纯化水定容至1l；所述膨胀剂包含：氟化钠0.1g~50g，磷酸二氢钾0.1g~10g，十二水合磷酸氢二钠0.1g~10g，氯化钾0.1g~10g及纯化水定容至1l；所述稳定剂包含：甲醛0.01g~10g，硫酸铜0.1g~10g，莲心碱0.1g~10g，氯化钠0.1g~50g，pc300 0.1g~10g及纯化水定容至1l。
45.优选地，所述强化剂包含：戊二醛0.25g，氯化钠10g，pc300 1g及纯化水定容至1l；所述洗涤液包含：氯化钠9g及纯化水定容至1l；所述膨胀剂包含：氟化钠8g，磷酸二氢钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g及纯化水定容至1l；所述稳定剂包含：甲醛0.1g，硫酸铜1g，莲心碱5g，氯化钠7g，pc300 1g及纯化水定容至1l。
46.下面以具体的实施例对本发明进行详细说明。
47.实施例一动物血液样本取自哺乳动物猪。
48.1.将取回的猪动物血液原材料进行过滤，去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质，取过滤后的血液100ml，使用离心机进行离心，在离心力1500g下离心2min，去除上清及中间层细胞，保留下层红细胞，使用洗涤液重新定容至100ml，在上述相同离心条件下离心洗涤两次，使用洗涤液将红细胞浓度调至5*10
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/l。
49.示例性的，可以通过过滤的方式对猪动物血液原材料进行过滤，去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质；或可以通过洗涤的方式对猪动物血液原材料进行过滤，去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质；或可以通过洗涤的方式对猪动物血液原材料进行过滤，去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质；可以通过过滤以及离心的方式对猪动物血液原材料进行过滤，去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质；或可以通过过滤以及洗涤的方式对猪动物血液原材料进行过滤，去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质；或可以通过过滤、离心以及洗涤的方式对猪动物血液原材料进行过滤，去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质。
50.2.使用强化剂与步骤1纯化后的红细胞悬浮液按1:1的比例进行混合，在30℃环境下水浴30min，在离心力1500g下离心2min，离心洗涤两次，在10khz下每间隔30秒超声30秒，共超声10次，使用洗涤液洗涤两次后，红细胞浓度调整为5*10
12
/l。
51.3. 使用膨胀剂与步骤2强化后的红细胞悬浮液按照4：1的比例进行混合，在25℃生化培养箱中放置48h，使用洗涤液洗涤两次后，红细胞浓度调整至5*10
12
/l。
52.4. 使用稳定剂与步骤3调整好大小的红细胞悬浮液按3:2的比例进行混合，在37℃生化培养箱中放置60min，使用洗涤液洗涤两次后，使用保存液进行保存，得到红细胞模拟物。
53.强化剂主要组成为：试剂名称含量多聚甲醛0.5g氯化钠8.5g笨甲醇30g纯化水定容至1l洗涤液主要组成为：试剂名称含量氯化钠9g纯化水定容至1l膨胀剂主要组成为：试剂名称含量氯化钠4g磷酸二氢钾0.2g十二水合磷酸氢二钠2.9g氯化钾0.2g纯化水定容至1l稳定剂主要组成为：试剂名称含量戊二醛0.05g醋酸铅2g马齿苋生物碱6g氯化钠8.5g
pc1501g纯化水定容至1l将实施例一中制得的红细胞模拟物在血细胞分析仪上进行监测，监测周期为20周，每周测试1次，每次取3个重复测试结果的平均值，观察红细胞mcv参数的变化。最终结果，猪动物红细胞原始mcv：59.6fl；处理后mcv：82.8fl，红细胞平均体积变化的极值为1.9fl，请参考图1。正常人红细胞mcv在80fl~100fl之间，处理后的红细胞模拟物的mcv落入正常人红细胞的mcv值范围内。因此，通过所述制备方法能够有效地将哺乳动物猪的血液制备成类似于人血液红细胞性质的红细胞模拟物。
54.实施例二动物血液样本取自哺乳动物大鼠。
55.1.将取回的大鼠动物血液原材料进行过滤，去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质，使用离心机进行离心，在离心力1500g下离心2min，去除上清及中间层细胞，保留下层红细胞，使用洗涤液将多个单体红细胞混合收集，并将红细胞浓度调至5*10
12
/l。
56.示例性的，可以通过过滤的方式去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质；或可以通过离心的方式去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质；或可以通过洗涤的方式去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质；或可以通过过滤以及离心的方式去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质；或可以通过过滤以及洗涤的方式去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质；或可以通过过滤、离心以及洗涤的方式去除血液样本中的不溶性的大颗粒和杂质。
57.2.使用强化剂与步骤1纯化后的红细胞悬浮液按1:1的比例进行混合，在30℃环境下水浴30min，在离心力1500g下离心2min，离心洗涤两次，在10khz下每间隔30秒超声30秒，共超声10次，使用洗涤液洗涤两次后，红细胞浓度调整为5*10
12
/l。
58.3. 使用膨胀剂与步骤2强化后的红细胞悬浮液按照2：1的比例进行混合，在20℃生化培养箱中放置24h，使用洗涤液洗涤两次后，红细胞浓度调整至5*10
12
/l。
59.4. 使用稳定剂与步骤3调整好大小的红细胞悬浮液按4:1的比例进行混合，在37℃生化培养箱中放置120min，使用洗涤液洗涤两次后，使用保存液进行保存，得到红细胞模拟物。
60.强化剂主要组成为：试剂名称含量戊二醛0.25g氯化钠10gpc3001g纯化水定容至1l洗涤液主要组成为：试剂名称含量氯化钠9g纯化水定容至1l膨胀剂主要组成为：试剂名称含量
氟化钠8g磷酸二氢钾0.2g十二水合磷酸氢二钠2.9g氯化钾0.2g纯化水定容至1l稳定剂主要组成为：试剂名称含量甲醛0.1g硫酸铜1g莲心碱5g氯化钠7gpc3001g纯化水定容至1l将实施例二中制得的红细胞模拟物在血细胞分析仪上进行监测，监测周期为20周，每周测试1次，每次取3个重复测试结果的平均值，观察红细胞mcv参数的变化。最终结果，大鼠动物红细胞原始mcv：72.3fl；处理后mcv：93.7fl，红细胞平均体积变化的极值为1.8fl，请参考图2。正常人红细胞mcv在80fl~100fl之间，处理后的红细胞模拟物的mcv落入正常人红细胞的mcv值范围内。因此，通过所述制备方法能够有效地将哺乳动物大鼠的血液制备成类似于人血液红细胞性质的红细胞模拟物。
61.通过本发明的制备方法还可有效地将牛、马、狗、兔或豚鼠等哺乳动物的血液制备成类似于人血液红细胞性质的红细胞模拟物，在此不再一一具体说明。
62.综上所述，本发明提供一种红细胞模拟物、其制备方法及质控物或校准物，采用该制备方法可以使动物血液红细胞与人类血液红细胞具有类似的性质，且性能稳定，可用于制备血细胞分析用质控物和校准物的红细胞模拟物，使用该红细胞模拟物能够准确反映人红细胞在仪器上的运行状态，提升仪器质控校准的准确性。
63.动物血液红细胞通过试剂处理，可改变动物血液红细胞的大小，使动物红细胞的大小范围与人类红细胞的大小范围达到一致，并且可以增强动物红细胞的稳定性，可以用来监测血细胞分析仪中红细胞的相关参数。先对动物血液进行纯化，去除血液中的白细胞及血小板，得到纯化的动物红细胞悬浮液，使用稀释液将红细胞稀释至一定浓度，使用强化剂增强细胞膜的强度，从而降低红细胞的脆性，然后对红细胞进行超声处理，通过离心等方式将细胞脆性较大的红细胞进行去除，保留细胞脆性较小的红细胞，使用膨胀剂对细胞进行处理，改变红细胞的大小使其接近人红细胞大小，最后使用稳定剂对细胞进行处理，增加红细胞的稳定性，以便红细胞模拟物的长期保存。
64.本文所描述的概念在不偏离其精神和特性的情况下可以实施成其它形式。所公开的具体实施例应被视为例示性而不是限制性的。因此，本发明的范围是由所附的权利要求，而不是根据之前的这些描述进行确定。在权利要求的字面意义及等同范围内的任何改变都应属于这些权利要求的范围。