用于BHK21细胞悬浮培养的血清替代物、培养液及制备方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种用于bhk21细胞悬浮培养的血清替代物、培养液及制备方法。

背景技术：

1、在利用悬浮液尽心干细胞培养的过程中，常利用血清来培养细胞，为细胞提供营养组分，由于不同的血清具体的组分之间具有差别，并不完全相同，使得细胞培养过程中不具有一致性，难以找出细胞培养中产生差异的因素，影响细胞的培养。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供一种用于bhk21细胞悬浮培养的血清替代物、培养液及制备方法，用以解决由于不同的血清使得细胞培养过程中产生差异的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，根据本发明实施例的用于bhk21细胞悬浮培养的血清替代物，包括组分：

4、氯化钾 20-80mg/l；

5、甘氨酸 10-60mg/l；

6、亚硒酸钠 0.02-0.08mg/l；

7、五水硫酸铜 0.003-0.009mg/l；

8、二氯化锰 0.0003-0.0009mg/l；

9、偏钒酸钠 0.0003-0.0009mg/l；

10、溴化钾 0.0003-0.0009mg/l；

11、氯化铬 0.0003-0.0009mg/l；

12、氯化钴 0.001-0.007mg/l；

13、氯化铷 0.001-0.007mg/l；

14、氯化镉 0.001-0.007mg/l；

15、乙酸钡 0.001-0.007mg/l；

16、氧氯化锆 0.001-0.007mg/l；

17、氟化钠 0.001-0.007mg/l；

18、钼酸铵 0.0003-0.0009mg/l；

19、氯化铜 0.0003-0.0009mg/l；

20、氯化铝 0.002-0.008mg/l；

21、氯化锂 0.001-0.007mg/l；

22、硫酸镍 0.001-0.007mg/l；

23、硝酸银 0.0002-0.0008mg/l；

24、氢化可的松 0.0002-0008mg/l；

25、乙醇胺 0.003-0.009mg/l；

26、亚油酸 0.01-0.07mg/l；

27、硫辛酸 0.002-0.008mg/l；

28、胆固醇 0.1-0.7mg/l；

29、维生素e醋酸酯 0.02-0.08mg/l；

30、肉豆蔻酸 0.001-0.007mg/l；

31、油酸 0.001-0.007mg/l；

32、棕榈酸 0.001-0.007mg/l；

33、硬脂酸 0.001-0.007mg/l；

34、吐温80 1-7mg/l；

35、重组人胰岛素 2-8mg/l；

36、羟乙基哌嗪乙磺酸 300-900mg/l；

37、辅助物，所述辅助物包括大豆水解物、水稻水解物、小麦水解物、蚕豆蛋白胨、土豆蛋白胨、豌豆蛋白胨和酵母水解物中的至少一种。

38、其中，所述辅助物包括：

39、大豆水解物 170-230mg/l；

40、水稻水解物 170-230mg/l；

41、小麦水解物 170-230mg/l；

42、蚕豆蛋白胨 170-230mg/l；

43、土豆蛋白胨 170-230mg/l；

44、豌豆蛋白胨 170-230mg/l；

45、酵母水解物 170-230mg/l。

46、其中，包括组分：

47、氯化钾 20-50mg/l；

48、甘氨酸 10-50mg/l；

49、亚硒酸钠 0.02-0.05mg/l；

50、五水硫酸铜 0.003-0.006mg/l；

51、二氯化锰 0.0003-0.0006mg/l；

52、偏钒酸钠 0.0003-0.0006mg/l；

53、溴化钾 0.0003-0.0006mg/l；

54、氯化铬 0.0003-0.0006mg/l；

55、氯化钴 0.001-0.004mg/l；

56、氯化铷 0.001-0.004mg/l；

57、氯化镉 0.001-0.004mg/l；

58、乙酸钡 0.001-0.004mg/l；

59、氧氯化锆 0.001-0.004mg/l；

60、氟化钠 0.001-0.004mg/l；

61、钼酸铵 0.0003-0.0006mg/l；

62、氯化铜 0.0003-0.0006mg/l；

63、氯化铝 0.002-0.005mg/l；

64、氯化锂 0.001-0.004mg/l；

65、硫酸镍 0.001-0.004mg/l；

66、硝酸银 0.0002-0.0005mg/l；

67、氢化可的松 0.0002-0005mg/l；

68、乙醇胺 0.003-0.006mg/l；

69、亚油酸 0.01-0.04mg/l；

70、硫辛酸 0.002-0.005mg/l；

71、胆固醇 0.1-0.4mg/l；

72、维生素e醋酸酯 0.02-0.05mg/l；

73、肉豆蔻酸 0.001-0.004mg/l；

74、油酸 0.001-0.004mg/l；

75、棕榈酸 0.001-0.004mg/l；

76、硬脂酸 0.001-0.004mg/l；

77、吐温80 1-4mg/l；

78、重组人胰岛素 2-5mg/l；

79、羟乙基哌嗪乙磺酸 300-600mg/l；

80、大豆水解物 200mg/l；

81、水稻水解物 200mg/l；

82、小麦水解物 200mg/l；

83、蚕豆蛋白胨 200mg/l；

84、土豆蛋白胨 200mg/l；

85、豌豆蛋白胨 200mg/l；

86、酵母水解物 200mg/l。

87、其中，包括组分：

88、氯化钾 40mg/l；

89、甘氨酸 30mg/l；

90、亚硒酸钠 0.05mg/l；

91、五水硫酸铜 0.005mg/l；

92、二氯化锰 0.0005mg/l；

93、偏钒酸钠 0.0005mg/l；

94、溴化钾 0.0004mg/l；

95、氯化铬 0.0005mg/l；

96、氯化钴 0.002mg/l；

97、氯化铷 0.003mg/l；

98、氯化镉 0.003mg/l；

99、乙酸钡 0.004mg/l；

100、氧氯化锆 0.004mg/l；

101、氟化钠 0.003mg/l；

102、钼酸铵 0.0005mg/l；

103、氯化铜 0.0004mg/l；

104、氯化铝 0.004mg/l；

105、氯化锂 0.003mg/l；

106、硫酸镍 0.003mg/l；

107、硝酸银 0.0004mg/l；

108、氢化可的松 0.0004mg/l；

109、乙醇胺 0.005mg/l；

110、亚油酸 0.02mg/l；

111、硫辛酸 0.003mg/l；

112、胆固醇 0.3mg/l；

113、维生素e醋酸酯 0.04mg/l；

114、肉豆蔻酸 0.004mg/l；

115、油酸 0.003mg/l；

116、棕榈酸 0.003mg/l；

117、硬脂酸 0.003mg/l；

118、吐温80 4mg/l；

119、重组人胰岛素 3mg/l；

120、羟乙基哌嗪乙磺酸 500mg/l；

121、大豆水解物 200mg/l；

122、水稻水解物 200mg/l；

123、小麦水解物 200mg/l；

124、蚕豆蛋白胨 200mg/l；

125、土豆蛋白胨 200mg/l；

126、豌豆蛋白胨 200mg/l；

127、酵母水解物200mg/l。

128、第二方面，根据本发明实施例的用于bhk21细胞悬浮培养的血清替代物的制备方法，包括：

129、将亚油酸、硫辛酸、胆固醇、维生素e醋酸酯、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸和吐温80溶于有机溶剂中，得到第一混合物；

130、将重组人胰岛素溶于冰醋酸中，得到第二混合物；

131、将上述所述的血清替代物中的其余各组分溶解于超纯水中，得到第三混合物；

132、将第一混合物、第二混合物和第三混合物混匀，过滤除菌，得到血清替代物。

133、第三方面，根据本发明实施例的培养液，包括上述实施例中所述的血清替代物。

134、其中，还包括：基础培养基，

135、所述基础培养基包括：

136、l-丙氨酸；

137、l－盐酸精氨酸；

138、l－门冬酰胺；

139、l－天门冬氨酸；

140、l－半胱氨酸盐酸盐一水；

141、l-胱氨酸二盐酸盐；

142、l－谷氨酸；

143、l－谷氨酰胺；

144、甘氨酸；

145、l－盐酸组氨酸一水；

146、l－羟脯氨酸；

147、l－异亮氨酸；

148、l－亮氨酸；

149、l－盐酸赖氨酸；

150、l－甲硫氨酸；

151、l－苯丙氨酸；

152、l－脯氨酸；

153、l－丝氨酸；

154、l－苏氨酸；

155、l－色氨酸；

156、l－缬氨酸；

157、氯化钠；

158、一水磷酸二氢钠；

159、二水氯化钙；

160、四水合硝酸钙；

161、氯化钾；

162、六水合氯化镁；

163、无水硫酸镁；

164、无水磷酸氢二钠；

165、七水硫酸锌；

166、七水合硫酸亚铁；

167、d－无水葡萄糖；

168、维生素c；

169、生物素；

170、氯化胆碱；

171、d-泛酸钙；

172、叶酸；

173、谷胱甘肽l；

174、次黄嘌呤；

175、肌醇；

176、亚油酸；

177、硫辛酸；

178、烟酰胺；

179、对氨基苯甲酸；

180、1,4-丁二胺二盐酸盐；

181、维生素 b6；

182、维生素 b2；

183、丙酮酸钠；

184、维生素 b1；

185、胸苷；

186、维生素 b12；

187、l-酪氨酸二钠盐二水。

188、其中，所述基础培养基包括：

189、l-丙氨酸 155mg/l；

190、l－盐酸精氨酸 310mg/l；

191、l－门冬酰胺 55mg/l；

192、l－天门冬氨酸 17mg/l；

193、l－半胱氨酸盐酸盐一水 18mg/l；

194、l-胱氨酸二盐酸盐 101mg/l；

195、l－谷氨酸 167mg/l；

196、l－谷氨酰胺 702mg/l；

197、甘氨酸 52mg/l；

198、l－盐酸组氨酸一水 68mg/l；

199、l－羟脯氨酸 10mg/l；

200、l－异亮氨酸 141mg/l；

201、l－亮氨酸 99mg/l；

202、l－盐酸赖氨酸 152mg/l；

203、l－甲硫氨酸 55mg/l；

204、l－苯丙氨酸 64mg/l；

205、l－脯氨酸 84mg/l；

206、l－丝氨酸 79mg/l；

207、l－苏氨酸 101mg/l；

208、l－色氨酸 27mg/l；

209、l－缬氨酸 97mg/l；

210、氯化钠 6500mg/l；

211、一水磷酸二氢钠 62mg/l；

212、二水氯化钙 117mg/l；

213、四水合硝酸钙 50mg/l；

214、氯化钾 463mg/l；

215、六水合氯化镁 53mg/l；

216、无水硫酸镁 73mg/l；

217、无水磷酸氢二钠 471mg/l；

218、七水硫酸锌 0.45mg/l；

219、七水合硫酸亚铁 0.43mg/l；

220、d－无水葡萄糖 4151mg/l；

221、维生素c 3mg/l；

222、生物素 0.15mg/l；

223、氯化胆碱 61.5mg/l；

224、d-泛酸钙 2.355mg/l；

225、叶酸 3.15mg/l；

226、谷胱甘肽 0.5mg/l；

227、次黄嘌呤 2.1mg/l；

228、肌醇 30mg/l；

229、亚油酸 0.042mg/l；

230、硫辛酸 0.1mg/l；

231、烟酰胺 5.3mg/l；

232、对氨基苯甲酸 0.52mg/l7；

233、1,4-丁二胺二盐酸盐 0.08mg/l；

234、维生素b6 2.5mg/l；

235、维生素b2 0.45mg/l；

236、丙酮酸钠 165mg/l；

237、维生素b1 2.6mg/l；

238、胸苷 0.8mg/l；

239、维生素b12 3mg/l；

240、l-酪氨酸二钠盐二水80mg/l。

241、其中，所述血清替代物与所述基础培养基的体积比为0.5-1.5。

242、第四方面，根据本发明实施例的培养液的制备方法，包括：

243、将基础培养基加入超纯水中溶解；

244、将血清替代物加入基础培养基溶液中混匀，得到混合液；

245、向混合液中加入碳酸氢钠调节ph；

246、过滤除菌，得到培养液。

247、本发明实施例中的用于bhk21细胞悬浮培养的血清替代物，包括组分：

248、氯化钾20-80mg/l；甘氨酸10-60mg/l；亚硒酸钠0.02-0.08mg/l；五水硫酸铜0.003-0.009mg/l；二氯化锰0.0003-0.0009mg/l；偏钒酸钠0.0003-0.0009mg/l；溴化钾0.0003-0.0009mg/l；氯化铬0.0003-0.0009mg/l；氯化钴0.001-0.007mg/l；氯化铷0.001-0.007mg/l；氯化镉0.001-0.007mg/l；乙酸钡0.001-0.007mg/l；氧氯化锆0.001-0.007mg/l；氟化钠0.001-0.007mg/l；钼酸铵0.0003-0.0009mg/l；氯化铜0.0003-0.0009mg/l；氯化铝0.002-0.008mg/l；氯化锂0.001-0.007mg/l；硫酸镍0.001-0.007mg/l；硝酸银0.0002-0.0008mg/l；氢化可的松0.0002-0008mg/l；乙醇胺0.003-0.009mg/l；亚油酸0.01-0.07mg/l；硫辛酸0.002-0.008mg/l；胆固醇0.1-0.7mg/l；维生素e醋酸酯0.02-0.08mg/l；肉豆蔻酸0.001-0.007mg/l；油酸0.001-0.007mg/l；棕榈酸0.001-0.007mg/l；硬脂酸0.001-0.007mg/l；吐温80 1-7mg/l；重组人胰岛素2-8mg/l；羟乙基哌嗪乙磺酸300-900mg/l；辅助物，所述辅助物包括大豆水解物、水稻水解物、小麦水解物、蚕豆蛋白胨、土豆蛋白胨、豌豆蛋白胨和酵母水解物中的至少一种。通过上述组分可以取代血清，上述组分可以通过精确地配制获得，使得每个批次的取代物完全相同，避免由于血清的不同导致的细胞培养过程中产生的差异，使得细胞培养过程中具有一致性，便于找出细胞培养中产生差异的因素，提高细胞的培养效果。