一种高产吡唑三嗪的方法

本发明属于生物，尤其是涉及一种高产吡唑三嗪的方法。

背景技术：

1、拮抗微生物产生的拮抗物质作为重要的生防因子，能够防治多种植物病害(李龚，刘娜，郑丽博.荧光假单胞菌植物病害防治及研究进展[j].分子植物育种，2018,16(11):3693-3697.)。其中，假单胞菌产生拮抗物质的生物合成和调控机制研究比较深入，例如吩嗪-1-羧酸(pca)和2，4二乙酰基间苯三酚(2，4-dapg)。研究发现，假单胞菌主要通过转录水平和转录后水平2种途径来调控拮抗物质合成基因簇的表达，从而调节拮抗物质的产量(gross,h.,loper,j.e.genomics of secondary metabolite production bypseudomonas spp[j].natural product reports.2009,26(11):1408-1446.)。

2、p.mosselii属于土壤腐生菌恶臭假单胞菌组(p.putida)的一个种，主要分布在植物的根际土壤中，是一种罕见的人类机会致病菌(dabboussi,f.,hamze,m.,singer,e.etal.pseudomonas mosselii sp.nov.,a novel species isolated from clinicalspecimens[j].international journal of systematic and evolutionarymicrobiology.2002,52(2):363-376.)。已有研究显示，p.mosselii具有抑制根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)和其它一些病原菌的能力(li,w.,wang,j.,jiang,x.etal.identification and characterization of a pseudomonas mosselii strain andits antibacterial function against agrobacterium tumefaciens[j].)。近期的报道显示，p.mosselii能够通过分泌一种抑菌蛋白pip-47aa来控制玉米的根虫害虫(wei,j.z.,o'rear,j.,schellenberger,u.et al.a selective insecticidal protein frompseudomonas mosselii for corn rootworm control[j].plant biotechnologyjournal.2018,16(2):649-659.)。邹华松等研究发现，通过对p.mosselii进行改造后，获得的工程菌株能够表达青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)的ripaa基因，具有防治烟草青枯病的能力(zhuo,t.,chen,s.,fan,x.et al.an improved control efficacyagainst tobacco bacterial wilt by an engineered pseudomonas mosseliiexpressing the ripaa gene from phytopathogenic ralstonia solanacearum[j].biorxiv.2019:510628.)。而且，p.mosselii bs011还能够通过产生一种环脂肽类化合物xantholysins来抑制稻瘟病菌(wu,l.,xiao,w.,chen,g.et al.identification ofpseudomonas mosselii bs011 gene clusters required for suppression of riceblast fungus magnaporthe oryzae[j].journal of biotechnology.2018,282:1-9.)。我们的研究显示，p.mosselii 923对稻黄单胞菌的两个致病变种：水稻条斑病菌(x.oryzaepv.oryzicola，xoc)和水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae，xoo)均具有显著的拮抗作用，同时对多种黄单胞属的其他植物病原细菌也具有一定的抑制效果，而且能够显著抑制稻瘟病菌的菌丝生长，表现广谱的抑菌能力。

3、中国专利cn108998389a公布了一种对稻黄单胞菌和稻瘟病菌具有拮抗作用的假单胞菌及应用，其菌株分离自上海市奉贤区水稻根际土壤，保藏名称为：摩氏假单胞菌pseudomonas mosselii 923，保藏编号：cctcc no:m 2018252。该专利证明假单胞菌对稻黄单胞菌表现显著的抑制作用，同时对黄单胞属的其他植物病原细菌和稻瘟病菌均具有较强的抑制能力，具有生物防治应用价值。但是该专利并没有公开是何种物质发挥对稻黄单胞菌和稻瘟病菌的拮抗作用。

4、吡唑三嗪(pseudoiodinine)是一种含多个氮原子的杂环分子，紫色，极性分子，它属于吡唑[4,3-e][1,2,4]三嗪(pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazine)类家族中的一种天然产物。

5、迄今，对吡唑三嗪(pseudoiodinine)生物学功能的研究主要集中于其衍生物的研究，具有抗癌、抗病毒和抗肿瘤的活性，其本身也具有抗病毒和抗肿瘤的活性，可作为抗人体肉瘤的药物，并预测能够治疗动脉粥样硬化。现有技术中吡唑三嗪化学合成方法步骤复杂、条件苛刻，其合成基因簇未知，并且其代谢调控的调控机制不详。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为：提供一种高产吡唑三嗪的方法，一方面避免其化学合成方法步骤复杂、条件苛刻的缺陷，另一方面，通过本发明的方法，提高其生物发酵效价水平，降低生产成本，以便后期吡唑三嗪在农业和医学疾病防控中的推广和应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明提供一种高产吡唑三嗪的方法，通过吡唑三嗪的合成基因簇合成获得，所述吡唑三嗪的合成基因簇核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、在本发明的一个实施方式中，所述吡唑三嗪的合成基因簇由psda、psdb、psdc、psdd、psde、psdf和psdg构成，核苷酸序列分别如seq id no.2、seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.12和seq id no.14所示，相应的氨基酸序列如seqid no.3、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9、seq id no.11、seq id no.13和seq idno.15所示。

5、在本发明的一个实施方式中，所述吡唑三嗪的合成基因簇来源于摩氏假单胞菌pseudomonas mosselii 923，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是：cctcc no：m2018252，保藏日期为2018年5月7日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心，在专利cn108998389a中有公开。

6、在本发明的一个实施方式中，所述摩氏假单胞菌pseudomonas mosselii 923含有的rsmy和rsmz基因能够正调控吡唑三嗪的生物合成，rsmy和rsmz基因的核苷酸序列分别如seq id no.16和seq id no.17所示。

7、在本发明的一个实施方式中，将摩氏假单胞菌pseudomonas mosselii 923菌株在tsb培养基中于30℃、220rpm条件下发酵36h，吡唑三嗪的合成基因簇合成得到吡唑三嗪。

8、本发明还提供基因psda、psdb、psdc、psdd、psde、psdf和psdg的应用，基因psda、psdb、psdc、psdd、psde、psdf和psdg同时存在于菌株中，使得菌株能够产生吡唑三嗪。

9、本发明还提供rsmy基因的应用，所述rsmy能够正调控吡唑三嗪的生物合成，rsmy基因的核苷酸序列如seq id no.16所示。

10、本发明还提供rsmz基因的应用，所述rsmz能够正调控吡唑三嗪的生物合成，rsmz基因的核苷酸序列如seq id no.17所示。

11、本发明通过研究发现摩氏假单胞菌pseudomonas mosselii 923菌株发酵后能够产生一种物质，即吡唑三嗪(pseudoiodinine)，是属于作为吡唑三嗪类家族的一种天然产物，其常见的生物活性是具有抗病毒和抗肿瘤的生物活性(dembitsky,v.m.,gloriozova,t.a.,poroikov,v.v.pharmacological and predicted activities of natural azocompounds[j].natural products and bioprospecting.2017,7(1):151-169.)。

12、本技术研究发现吡唑三嗪(pseudoiodinine)对植物病原黄单胞菌，尤其是稻黄单胞菌xoc rs105和xoo px099a均表现很强的抑菌活性，能够有效的防治水稻白叶枯病和条斑病，另外，吡唑三嗪(pseudoiodinine)对于水稻第一大病害稻瘟病菌也具有明显的拮抗作用。这表明，吡唑三嗪(pseudoiodinine)具有较好的生防应用前景。

13、本技术进一步研究发现了合成基因簇由psda、psdb、psdc、psdd、psde、psdf和psdg构成，并且通过研究发现了其代谢调控的调控机制。

14、与现有技术相比，本发明的方法，通过合成基因簇来合成吡唑三嗪(pseudoiodinine)，其产量高，本发明方法得到的吡唑三嗪为后期在农业和医学疾病防控中的推广和应用提供了新的思路和途径。