一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法。


背景技术：

2.牛白血病病毒(bovine leukemia virus，blv)属于反转录病毒科(retroviridae)，丁型反转录病毒属(deltaretrovims)，其基因组长度约为8.7kb。病毒基因组包括两端的长末端重复序列ltrs，结构基因gag，pro，pol，env以及非结构基因tax，rex，g4，r3，as。结构蛋白gp51(env)和p24(gag)是病毒活跃复制的指标，由于它们是主要的抗原蛋白，通常被用于血清学诊断。该病毒的感染会引起牛淋巴细胞持续性增生(persistentlymphocytosis，pl)，从而导致牛地方流行性白血病(enzooticbovine leukosis，ebl)。迄今为止，国内外研究人员对blv在病毒生物学特性、致病机理、诊断方法和疫苗研究等方面做了一些工作。但是，目前仍然缺乏有效的防控手段并且国内未有关于构建牛白血病病毒全长感染性克隆的报道。因此，构建牛白血病病毒全长感染性克隆，有利于深入开展病毒的分子生物学特性、复制机制、致病机理等研究，有利于我们全面透彻的了解blv，从而为开发高效的blv诊断试剂和疫苗提供理论依据。


技术实现要素：

3.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
4.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
5.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法，其包括如下步骤：
7.引物设计：根据目标菌株基因组序列设计引物；
8.基因扩增和构建质粒：使用引物对于目标基因进行pcr扩增；
9.病毒拯救：培养细胞，转染，然后进行传代，熔融后每一代做if，观察增值情况；
10.病毒拯救鉴定：进行合胞体观测、遗传稳定性分析，抗原检测，逆转录酶活性测定；
11.鉴定结果：观测病毒拯救鉴定结果。
12.作为本发明所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：引物设计中，所述引物针对的为blv毒株全基因组序列。
13.作为本发明所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：引物设计中，得到的引物包括seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8。
14.作为本发明所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：基因扩增和构建质粒中，所述seq id no.1、seq id no.2配合扩增基因a，所述seq id no.3、seq id no.4配合扩增基因b，seq id no.5、seq id no.6配合扩增基因c，seq id no.7、seq id no.8配合扩增基因d。
15.作为本发明所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：基因扩增和构建质粒中，使用pcr进行基因扩增，所述seq id no.1、seq id no.2所扩增的目的基因与所述seq id no.3、seq id no.4所扩增的目的基因进行融合pcr。
16.作为本发明所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：基因扩增和构建质粒中，使用pcr进行基因扩增，所述seq id no.5、seq id no.6所扩增的目的基因与所述seq id no.7、seq id no.8所扩增的目的基因进行融合pcr。
17.作为本发明所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：病毒拯救中，使用的培养基为加入2ml的含10％的胎牛血清的dmem培养基。
18.作为本发明所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：病毒拯救时，进行传代培养，每代选取一半细胞进行3次冻融，每间隔一代做一次if检测病毒繁殖情况。
19.作为本发明所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：病毒拯救鉴定包括遗传稳定性分析，传代13次后，采用if与rt-pcr检测遗传稳定性。
20.作为本发明所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：病毒拯救鉴定包括逆转录酶活性测定，所述逆转录酶活性测定包括转染，转染完成培养，手机培养细胞冻融3次，离心，取上清液过滤，然后再进行超速离心，重悬备用。
21.本发明提供了前述的引物或者前述的制备方法在制备blv诊断实际和/或疫苗中的应用，以及前述的制备方法制备的牛白血病病毒全长感染性克隆。本发明能够构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆并能成功拯救出病毒。本发明为深入开展blv的基础和应用研究提供了有效平台，具有重要的科学应用价值。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
23.图1为本发明的牛白血病病毒的基因组结构的示意图；
24.图2为合胞体观测的结果示意图；
25.图3为鉴定结果鉴定步骤的效果示意图，其中图3a为间接免疫荧光检测抗原以及遗传稳定性分析的结果示意图，图3b为转染后传代的tb 1 lu细胞rt-pcr的结果示意图；
26.图4为反转录酶活性测定的结果示意图；
27.图5为得到的基因片段与pcaggs-blv17985的测序结果的对比示意图。
具体实施方式
28.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例
对本发明的具体实施方式做详细的说明。
29.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
30.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
31.本发明实施例中使用的材料包括如下：
32.准备blv毒株(genbank accession numbers:ol451224)，除毒株外还包括tb 1 lu细胞、vero细胞、pcaggs载体、dh5a感受态细胞由本实验室保存，blv毒株(genbank accession numbers:ol451224)的序列如seq id no.1所示，本实验室保存编号为c202766。
33.限制性内切酶primestar gxl dna polymerase购自宝日医生物技术有限公司；clone express ultra one step cloning kit、dl5000dna marker和dl15000dna marker均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；giemsa染色液购自索莱宝科技有限公司；blv-p24多抗为美国一生物公司合成；fitc-goat anti-mouse igg购自kpl公司；dapi染色液购自碧云天生物技术有限公司；high pure pcr template preparation kit购自roche；axyprep plasmid miniprep kit购自axygen；reverse transcriptase assay kit购自thermo fisher scientific；酶标仪购自tecan；凝胶成像系统购自tanon公司；pcr仪购自applied biosystems公司；倒置相差显微镜购自olympus公司；荧光显微镜购自德国leica。
34.实施例1
35.根据当前已经公布的blv毒株，选择(genbank accession numbers：ab987702、mh170030、lc080656)全基因组序列设计引物，由南京擎科生物有限公司合成。制得的引物序列表如表1所示。
36.表1全长感染性克隆所需引物
[0037][0038][0039]
注：f：正向引物，r：反向引物。
[0040]
提取blv17985的基因组dna。以基因组dna为模板，分别用引物a(seq id no.1-2)、b(seq id no.3-4)、c(seq id no.5-6)、d(seq id no.7-8)通过pcr扩增，得到a、b、c、d片段；凝胶纯化回收a、b、c、d片段备用；再将a、b两个片段，c、d两个片段分别利用融合pcr得到片段a+b、c+d，pcr的具体条件为a、b两个片段，c、d两个片段分别利用引物对a-f/b-r、c-f/
d-r进行融合pcr，扩增条件为：98℃10s；56℃15s；68℃4min20s。得到片段a+b、c+d。然后使用sacι与xhoι内切酶将pcaggs载体进行双酶切线性化，凝胶纯化回收备用。最后使用clone express ultra one step cloning kit重组a+b片段、c+d片段与线性化载体，得到pcaggs-blv17985，将其送到南京擎科生物有限公司进行全长测序。
[0041]
pcaggs-blv17985感染性克隆质粒中重组病毒全长基因组序列见ol451224；基因组结构图见图1。pcaggs-blv17985感染性克隆质粒保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022291。
[0042]
按lipofectamine
tm
3000试剂盒说明书操作，当单层tb 1 lu细胞在6孔细胞培养板生长铺至70％-80％，先弃掉细胞培养上清，然后加入2ml新鲜的含10％胎牛血清的dmem培养基，取2.5ug样品/孔进行转染，放置到37℃、5％co2培养箱，培养至68h时开始进行传代，传代时每一代都收取一半细胞进行3次冻融，每次传代时接入上一代细胞的冻融产物(第一代除外)，期间每间隔一代做一次if，监测病毒增殖情况，待传至11代时，病毒增殖趋于稳定，此时收集细胞进行冻融，将拯救出的病毒命名为pblv17985。
[0043]
实施例2
[0044]
合胞体观测：
[0045]
blv的env蛋白会导致某些细胞形成合胞体。按照1.5转染步骤，用pcaggs-blv17985转染本实验室保存的cos 7、mdbk、tb 1 lu、vero这4种细胞，24h与48h时观察细胞病变，24h发现部分细胞形成合胞体，48h发现细胞形成大量合胞体。弃去细胞培养液，甲醇固定细胞2-3min，giemsa染色液室温染色15-30min，自来水洗去染色液晾干后镜检。
[0046]
pblv17985在tb 1 lu细胞上的遗传稳定性分析：
[0047]
使用pcaggs-blv17985转染生长铺至70％-80％的tb 1 lu细胞，在tb 1 lu细胞上连续传代13次，传代时每一代都收取一半细胞进行冻融，每次传代时接入上一代细胞的冻融产物(第一代除外)，然后采用if与rt-pcr检测pblv17985在tb 1 lu细胞上的遗传稳定性。
[0048]
间接免疫荧光检测抗原：
[0049]
如前所述，pcaggs-blv17985转染tb 1 lu细胞后，连续传代13次，每隔一代取细胞铺96孔细胞培养板做if，同时设置空白对照组。用pbs洗2遍，加甲醇：丙酮(1:1),-20℃固定通透30min，用pbs洗2遍；5％脱脂乳封闭2h，用pbs洗3遍；一抗为blv-p24多抗，37℃孵育3h，用pbs洗5遍；二抗为fitc-goat anti-mouse igg，37℃避光孵育2h，用pbs洗5遍；dapi染色液室温避光染色5min；然后观察荧光。
[0050]
逆转录酶活性测定：
[0051]
转染步骤如前1.5所述，同时设置转染空pcaggs质粒孔以及不进行转染的阴性孔作为对照。放置到37℃、5％co2培养箱培养，培养至68h时将试验组的细胞以及培养上清收集起来。将收集的细胞悬液冻融3次,在4℃下2000g离心10min然后取离心后的上清液过0.45μm的滤器。过滤后的液体超速离心，30000rpm/min，4℃离心2h，最后将获得的纯病毒用100μlpbs重悬，置于-80℃备用。转染空pcaggs质粒组和阴性对照组处理方式与试验组相同。
[0052]
按reverse transcriptase assay kit说明书操作，处理样品后使用酶标仪测定逆转录酶活性。
[0053]
实施例3
[0054]
合胞体观测：
[0055]
在tb 1 lu细胞与vero细胞中观察到大量合胞体，其余2种细胞中未观察到合胞体(图2)。
[0056]
pblv17985遗传稳定性分析：
[0057]
if与qpcr结果显示，pblv在tb 1 lu细胞上可以稳定遗传13代且随着代数增加病毒滴度略微上升(图3a.b.)。
[0058]
间接免疫荧光检测抗原：
[0059]
pcaggs-blv转染的tb 1 lu在传代过程中，持续观察到有特异性的绿色荧光，表明细胞中有p24蛋白的表达；而作为空白对照的正常tb 1 lu细胞无特异荧光产生(图3a)。
[0060]
逆转录酶活性测定：
[0061]
结果显示试验组与阴性组相比，显示出较强反转录酶活性试验阳性(图4)。
[0062]
将扩增得到的4个blv片段a、b、c、d连接到t载体上，送往南京擎科生物有限公司测序，并将测序结果进行拼接。将得到的拼接结果与pcaggs-blv17985的测序结果进行比对。比对结果如图5所示，由图5可得，我方发明中对于pcaggs-blv17985有着良好、准确的克隆结果。
[0063]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。