一种鼠疫耶尔森菌检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种鼠疫耶尔森菌检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。

背景技术：

1、鼠疫(plague)是鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)引起的甲类烈性传染病，多数通过跳蚤从野生啮齿动物的动物宿主中传播给其他动物和人类。气溶胶化细菌的连续空气传播也可导致原发性肺鼠疫流行。临床主要表现为高热、淋巴结肿痛、出血倾向、肺部炎症等。人群对鼠疫耶尔森杆菌普遍易感，鼠疫传染性强，如果不治疗，病死率高达30％～60％。鼠疫耶尔森杆菌是一种革兰氏阴性的球杆菌，有荚膜，既是需氧菌也是厌氧杆菌，适宜的温度是27-28℃，故耶尔森杆菌对外界的抵抗力非常强。鼠疫在亚洲、非洲和美洲的自然疫源地流行。鼠疫通常与贫困、卫生条件差有关，而且在医疗基础设施简陋的国家经常会遇到大量病例，再者鼠疫因为很容易在人与人之间传播，导致高死亡率并具有重大公共卫生的潜在影响，所以制备鼠疫生物制剂显得尤为重要。

2、鼠疫耶尔森菌针对其基因组中毒力质粒ppcp1(pla基因)和pmt1(caf1、ymt基因)的实时pcr测定结果与抗原免疫层析测试和生物体培养进行了比较。发现其他监测手段操作复杂、耗时长、灵敏度低，且不能用于疾病的早期诊断。实时荧光定量pcr技术是目前应用最广泛的用于病原菌筛查的分子检测法，该技术不仅实现了对病原菌核酸的定量，而且具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、自动化程度高等特点。例如，专利cn101824468a公开了一种鼠疫耶尔森菌检测用引物组、快速诊断试剂盒和检测方法，在不到1小时即可完成扩增反应，检测成本低、耗时短、产率高，特异性高，验证率高。

3、对于病原体的核酸检测，市场现有检测系统或方法通常需要在检测前进行样品处理，本技术人基于该问题，与在先前申请cn202110057507.0中公开了一种新型现场化快速核酸扩增检测仪carryon p1000q，该设备为“手持全自动封闭式核酸qpcr分析系统”，可在60分钟内完成新冠病毒的现场自动化核酸检测，能够实现“样品进，结果出”的快速检测。本技术即在该技术的基础上，进一步研发出的，能够更好的配合该设备的试剂类发明，即鼠疫耶尔森菌的微流控芯片试剂盒。

4、现有的检测试剂盒及方法较操作时间长，且操作步骤繁琐，因此，亟需提供一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便、省时且节约成本的鼠疫耶尔森菌检测试剂盒及其使用方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的上述问题，本技术提供了一种鼠疫耶尔森菌检测的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明所述的引物探针组合物检测鼠疫耶尔森菌，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

3、一方面，本发明提供了一种检测鼠疫耶尔森菌的引物探针组合物，所述的引物探针组合物包括检测鼠疫耶尔森菌的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。

4、具体地，所述的检测鼠疫耶尔森菌的引物探针组合物为ypst引物探针组合物。

5、具体地，所述的检测内参的引物探针组合物为ipc引物探针组合物。

6、进一步具体地，

7、(1)所述的ypst引物探针组合物为：

8、f(seq id no:1)：5'-atttaactgcaagcaccact-3'；

9、r(seq id no:2)：5'-tatagccgccaagagtaagcgta-3'；

10、p(seq id no:3)：5'-actcttgttgaaccagcccgcatc-3'；

11、(2)所述的ipc引物探针组合物为：

12、f(seq id no:4)：5'-agttgcagtgtaaccgtcatgta-3'；

13、r(seq id no:5)：5'-tcgacgagactctgctgttaa-3'；

14、p(seq id no:6)：5'-cagtaatctgcgtcgcacgtgtgca-3'。

15、具体地，所述的鼠疫耶尔森菌的引物探针组合物用于检测鼠疫耶尔森菌的pmt1质粒的caf1基因。

16、具体地，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述探针的3'端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团为cy3、cy5、cy5.5、fam、hex、vic、joe或rox中的一种或多种，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。

17、进一步具体地，所述的检测鼠疫耶尔森菌的探针用fam标记，所述的检测内参ipc的探针用cy5标记。

18、另一方面，本发明提供了上述引物探针组合物在制备检测鼠疫耶尔森菌产品中的应用。

19、具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

20、又一方面，本发明提供了一种检测鼠疫耶尔森菌的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。

21、具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

22、具体地，所述的产品还包括纯化试剂、冻干试剂和ipc质控品。

23、进一步具体地，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和triton x-100，所述的洗脱液包括tris-hcl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠。

24、进一步具体地，所述的裂解液包括6m盐酸胍、0.4m ph4.7醋酸钠和2％triton x-100，所述的洗脱液包括10mm ph8.5 tris-hcl。

25、进一步具体地，所述的冻干试剂包括脂多糖、羧丙基甲基纤维素、甘露醇、海藻糖、普鲁兰多糖、2-羟丙基-β-环糊精、脱氧核糖核酸聚合酶、牛血清白蛋白、消泡剂、脱氧核苷三磷酸、kci、tris-hci(ph 9.0)、mgcl2、tween 20。

26、进一步具体地，所述的ipc质控品以冻干球的形式存在于微流控芯片中；

27、所述的ipc质控品的人工合成序列为seq id no:7；

28、所述的ipc质控品是dna质粒；

29、所述的ipc质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、2-羟丙基-β-环糊精、消泡剂、tris-hcl(ph 8.0)、nacl、tween20。

30、又一方面，本发明还提供了一种检测鼠疫耶尔森菌的微流控芯片试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物探针组合物。

31、具体地，所述的试剂盒还包括纯化试剂、冻干试剂和ipc质控品。

32、所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和triton x-100，所述的洗脱液包括tris-hcl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠；

33、所述的冻干试剂包括脂多糖、羧丙基甲基纤维素、甘露醇、海藻糖、普鲁兰多糖、2-羟丙基-β-环糊精、脱氧核糖核酸聚合酶、牛血清白蛋白、消泡剂、脱氧核苷三磷酸、kci、tris-hci(ph 9.0)、mgcl2、tween 20。

34、所述的ipc质控品以冻干球的形式存在于微流控芯片中；

35、所述的ipc质控品的人工合成序列为seq id no:7；

36、所述的ipc质控品是dna质粒；

37、所述的ipc质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、2-羟丙基-β-环糊精、消泡剂、tris-hcl(ph 8.0)、nacl、tween20。

38、所述的试剂盒在微流控芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。

39、具体地，所述的微流控芯片试剂盒可用于carryon p1000q快速核酸扩增检测仪。

40、又一方面，本发明提供了上述引物探针组合物、产品或试剂盒在检测鼠疫耶尔森菌中的应用。

41、又一方面，本发明提供了一种检测鼠疫耶尔森菌的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，所述的方法包括利用上述引物探针组合物、产品或试剂盒对待测样本中鼠疫耶尔森菌进行检测。

42、具体地，所述的方法包括以下步骤：

43、(1)提取样本的dna并采用上述纯化试剂进行纯化；

44、(2)利用上述引物探针组合物扩增步骤(1)提取并纯化的样本dna；

45、(3)对扩增结果进行分析。

46、进一步具体地，上述步骤采用carryon p1000q快速核酸扩增检测仪，在微流控一体化芯片上进行。

47、与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有如下有益效果：

48、(1)采用本发明提供的引物探针组合物检测鼠疫耶尔森菌，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

49、(2)利用芯片上微流控的方式解决病原体快速检测的问题，实现“样本进-结果出”的poct检测方案，取样后直接加入设备，纯化加扩增，60分钟内出结果。