一种micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法

一种micorrna206抑制hcv增殖的建立方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种micorrna206抑制hcv增殖的建立方法。


背景技术：

2.目前，丙型肝炎病毒(hepatitis c virus，hcv)感染是引起世界范围慢性病毒性肝病的主要病因之一，其引起的丙型肝炎最终可导致肝硬化甚至肝细胞癌。由于目前尚缺乏hcv的疫苗，且其具体的致病机制尚未被完全阐明。研究表明宿主因素与hcv的感染、致病过程及患者治疗效果有密切关系，因此对其进行研究将有助于hcv感染的预防和个体化治疗。
3.microrna(mirna)是一类内源性非编码小分子rna，具有调控细胞分化、增殖、凋亡和代谢等多种生物学功能，同时参与感染性疾病、代谢性疾病及肿瘤等多种疾病的发生过程。mirna通过结合靶标基因的非编码区来抑制mrna的翻译过程或降解mrna，进而调控转录后基因表达过程。近年来，越来越多的mirna被证实与hcv的感染密切相关。
4.microrna-206(mir-206)位于人类6号染色体上，在脊椎动物中高度保守。mir-206首次按在骨骼肌中被发现，并被认为是骨骼肌特异性表达microrna。随后，在心脏、肺、脑和肝脏等组织中也发现mir-206的表达，并且参与到这些器官的生理和病理反应过程中。目前为止，mir-206已被证实与乳腺癌、结肠癌、横纹肌肉瘤等肿瘤的发生具有相关性。最近发现在肝细胞癌的患者中mir-206的表达量明显低于正常人，并且其表达量与肝癌细胞的分化程度、癌细胞的结节数量、淋巴结转移以及肝癌的进展等相关，体外实验证实mir-206可以减少肝癌细胞的增殖、浸润和转移速度，并能加速其凋亡，但是具体的致病机制尚未完全阐明。目前对于mir-206与肝细胞癌的研究较少，部分研究证实mir-206在肝组织代谢过程中发挥重要作用，但尚未见mir-206与hcv复制增殖的相关报道。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
6.(1)由于目前尚缺乏hcv的疫苗，且其具体的致病机制尚未被完全阐明。
7.(2)尚未见mir-206与hcv复制增殖的相关报道，其可能是潜在的hcv治疗药物。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种micorrna206抑制hcv增殖的实验方法及检测方法。
9.本发明所述micorrna206抑制hcv增殖方法和检测方法的建立包括：
10.mir-206转染入hcv感染的细胞过表达，通过荧光定量pcr检测mir-206相对表达量，并通过评估hcv的病毒载量及蛋白表达量分析microrna-206的抑制效果。
11.进一步，所述micorrna206抑制hcv增殖的建立方法还包括：
12.预先合成带有cy5基团的mir-206模拟物，确定最佳感染复数与转染量，并通过激光共聚焦与qrt-pcr分别检测mir-206的转染效率以及表达量；验证hcv病毒感染12h后，过
表达mir-206对hcv病毒增殖的抑制作用。
13.进一步，所述hcv病毒载量检测引物序列为seq id no：1和seq id no：2，探针序列为seq id no：3。
14.seq id no：1：tgctcatgat gcacggtcta c
15.seq id no：2：tgcggaaccg gtgagtacat
16.seq id no：3：caccctatca ggcagtacca caaggcc
17.进一步，所述检测mir-206表达量引物的序列为seq id no：4和seq id no：5。
18.seq id no：4：cttcccgagg ccacatgc
19.seq id no：5：cacttgccga aaccacac
20.进一步，所述micorrna206抑制hcv增殖的建立方法包括以下步骤：
21.步骤一，确定hcv对细胞的感染复数，以达到最优的hcv感染效果；
22.步骤二，转染试剂用量与mir-206转染浓度的确定，使mir-206转染浓度和比例达到最佳水平；
23.步骤三，mir-206表达量的检测，确定mir-206转染成功；
24.步骤四，hcv病毒载量及蛋白的检测，检测mir-206对hcv的抑制效果。
25.更详细的步骤为，设置不同感染复数对细胞进行感染，在感染12h后，通过间接免疫荧光确定hcv感染复数。
26.进一步，所述感染复数moi＝0.1、0.3、1、2、3。
27.进一步，所述步骤二中，设置不同转染试剂lipofectamientm 3000与mir-206mimics用量，在转染24h后通过qpcr检测mir-206表达情况，确定转染试剂与mir-206mimics的最佳用量。
28.进一步，所述不同转染试剂lipofectamientm 3000的体积依次为0.75μl、1.5μl和3μl；20nm mir-206mimics转染体积为0.5μl、1.5μl和2.5μl。
29.进一步，通过cck-8试剂盒检测hcv病毒感染与转染mir-206mimics对细胞活性的影响。
30.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
31.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
32.本发明旨在建立microrna-206(mir-206)抑制hcv增殖的实验方法，主要提供mir-206转染入细胞过表达，并通过荧光定量pcr检测mir-206相对表达量，通过评估hcv的病毒载量及其蛋白表达量分析microrna-206的抑制效果。
33.本发明通过cck-8试剂盒检测hcv病毒感染与转染mir-206mimics对细胞活性的影响，以验证感染与转染方法可用于后续发明。
34.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
35.本发明建立了检测mir-206抑制hcv增殖的实验和检测方法。该方法的建立为生物药物抑制hcv增殖的检测提供了新方向。
36.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
37.(1)本发明所提供技术可能作为抗hcv新型生物药物的基础；
38.(2)本发明的所技术方案在国内外尚无报道，为mir-206抑制hcv提供理论支持。
附图说明
39.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
40.图1是本发明实施例提供的micorrna206抑制hcv增殖建立方法流程图；
41.图2是本发明实施例提供的各时间点不同处理组细胞活性实验结果示意图，结果显示各时间点处理组与对照组间细胞活性无明显差异；
42.图3是本发明实施例提供的mir-206最佳浓度转染24h后rt-qpcr结果示意图；结果显示转染组mir-206表达量明显高于对照组，且具有显著差异；
43.图4是本发明实施例提供的转染mir206激光共聚焦结果示意图；在细胞质中观察到红色荧光，表明mir-206成功转染进入细胞；
44.图5是本发明实施例提供的上清与细胞hcv病毒增殖状况示意图；
45.图5a是本发明实施例提供的上清hcv病毒载量变化情况示意图，结果显示转染组与未转染组相比在48～72h期间病毒增长速率明显减缓；
46.图5b是本发明实施例提供的细胞内hcv病毒载量变化情况示意图，其与上清呈现出一致的趋势；
47.图6是本发明实施例提供的mir-206过表达抑制hcv core蛋白表达结果示意图；在转染后48h检测hcv core蛋白表达量，结果显示过表达mir-206明显抑制了hcv core蛋白的表达。
具体实施方式
48.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
49.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种micorrna206抑制hcv增殖的建立方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
50.如图1所示，本发明实施例提供的micorrna206抑制hcv增殖的建立方法包括以下步骤：
51.s101，确定hcv对细胞的感染复数；
52.s102，转染试剂用量与mir-206转染浓度的确定；
53.s103，mir-206表达量的检测；
54.s104，hcv病毒载量及蛋白的检测。
55.本发明实施例提供的micorrna206抑制hcv增殖的建立方法具体包括：
56.1、设置不同感染复数(moi＝0.1、0.3、1、2、3)对细胞进行感染，在感染12h后，通过
间接免疫荧光确定hcv感染复数。
57.2、设置不同转染试剂lipofectamientm 3000(0.75μl、1.5μl和3μl)与mir-206mimics(20nm mir-206mimics转染体积为0.5μl、1.5μl和2.5μl)用量，在转染24h后通过qpcr检测mir-206表达情况，确定转染试剂与mir-206mimics的最佳用量。
58.3、进一步通过cck-8试剂盒检测hcv病毒感染与转染mir-206mimics对细胞活性的影响，以验证上述感染与转染方法可用于后续发明。
59.4、hcv病毒载量检测引物，序列为seq id no：1(tgctcatgat gcacggtcta c)和seq id no：2(tgcggaaccg gtgagtacat)，探针序列为seq id no：3(caccctatca ggcagtacca caaggcc)。
60.5、检测mir-206表达量引物，序列号为seq id no：4(cttcccgagg ccacatgc)和seq id no：5(cacttgccga aaccacac)。
61.本发明专利可以直接应用于mir-206对细胞中hcv感染的抑制成分。首先，转染mir-206后hcv的感染受到了抑制，且这种抑制作用并非由于细胞活性受到抑制导致的。相比较于未转染mir-206的hcv感染细胞组，转染mir-206组细胞的hcv增殖速度显著降低。由此可知，细胞感染hcv后，mir-206具有抑制hcv增殖的功能，该技术有望临床上治疗hcv患者时与现有药物联合应用。
62.本发明预先合成带有cy5基团的mir-206模拟物(mir-206mimics)，而后确定最佳感染复数与转染量，并通过激光共聚焦与qrt-pcr分别检测mir-206的转染效率以及表达量。进一步验证hcv病毒感染12h后，过表达mir-206对hcv病毒增殖的抑制作用。以下为具体实施步骤，下述实例中的实验方法，均设置三次重复实验，结果取平均值。
63.1、本发明所用细胞及病毒的培养实例
64.本发明所用细胞为本实验室保存的人肝癌细胞系huh7.5.1。采用含10％血清、1％青链霉素、1％hepes的dmem完全培养基，于5％co2浓度37℃的恒温培养箱中培养。
65.(1)将huh7.5.1复苏在t25培养瓶并确保其状态良好。当细胞在培养瓶中融合度达到60～70％左右时适宜接入病毒。
66.(2)向细胞中接入适宜的hcv病毒(moi＝1)，将病毒液加到液面以下，并轻轻晃动培养瓶使其与培养基混匀，并在感染12h后进行换液。t25培养瓶中加入的病毒液体积以100～200μl最佳。
67.(3)当细胞融合度达到100％后，按照一传三的方式传至t25中。传代后的细胞融合度达到100％时，若细胞状态良好可接着传代，若出现明显的病变，如裂解、分叉即可收毒。
68.(4)收集细胞培养的上清液，用0.22μl的滤膜过滤并分装，-80℃冰箱保存备用。分装出200μl病毒用于病毒载量检测。
69.2、间接免疫荧光确定hcv最佳感染复数实例
70.(1)最佳感染复数实验设置5个梯度，具体分别为moi＝0.1、0.3、1、2、3，若当moi＝1时，假设铺板细胞量为1.5
×
104个计算，则需要向该孔中加入1.5
×
103个病毒，其它moi按相同的方式计算。
71.(2)将密度为5
×
104cells/ml细胞悬浮液以100μl/孔铺至96孔板中，铺板12h后按上述设置moi感染hcv病毒。
72.(3)病毒感染12h后，洗净培养基，用pbs清洗2次，每孔加100μl固定液，于－20℃固
定30min。
73.(4)弃掉固定液，用pbst清洗，每孔加100μl封闭液，室温封闭2h。
74.(5)弃掉封闭液，用pbst清洗，每孔加50μl一抗稀释液(1：500)，室温孵育2h。
75.(6)回收一抗，用pbst清洗3次，5min/次，每孔加100μl二抗稀释液(1：1000)，室温孵育2h，避光操作。
76.(7)弃二抗，用pbst清洗3次，5min/次，每孔加50μl dapi稀释液(1：2000)，核染色10min。
77.(8)弃掉dapi染液，用pbst洗3次，用倒置荧光显微镜拍荧光。根据moi孔中的荧光推断最适moi。
78.3、mir-206过表达检测与最佳浓度确定实例
79.(1)将mir-206模拟物(ribobio)并按照说明书将干粉稀释成20μm的储存液，将稀释好的储存液50μl/管分装，置于－20℃储存。
80.(2)将状态良好的细胞以1
×
105cells/ml密度铺于12孔板中，待融合度达到60～70％后，将带有cy5荧光基团的mir-206mimics转染进入细胞。根据mir-206说明书设置转染终浓度梯度，终浓度梯度分别为10nm、30nm和50nm(即转染20nm mir-206mimics体积分别为0.5μl、1.5μl和2.5μl)。
81.(3)使用lipofectamine
tm 3000转染试剂将mirna-206mimics转染进细胞中。即将lipofectamien
tm 3000(0.75μl、1.5μl和3μl)和mir-206mimics(0.5μl、1.5μl和2.5μl)分别用50μl无血清的纯培养基进行稀释，将lipofectamien
tm
3000稀释液转移到mir-206mimics稀释液中混匀，室温孵育10min后，加至孔板中。通过检测mir-206表达量确定最适转染用量与mir-206转染量。
82.(4)用mirnaisolation kit试剂盒(omega)对细胞中mirna进行提取。
83.(5)测rna浓度，用mircute增强型mirna cdna第一链合成试剂盒(tiangen)对提取的rna按同一浓度进行逆转录。
84.(6)使用mircute plus mirnaqpcr detection kit试剂盒(tiangen)检测mirna-206的表达情况。
85.表1 u6与mir-206引物序列
[0086][0087]
反应体系(20μl)：2
×
mircute plus mirnapremix(sybr&rox)，50
×
rox reference dye，正反向引物各0.4μl，2μl的模板，余下的用ddh2o补齐。
[0088]
表2 u6与mir-206qpcr反应条件
[0089]
[0090][0091]
4、通过cck检测病毒感染与转染对细胞活性实例
[0092]
本发明设置有对照组(nc组，不对细胞进行任何处理)、感染组(感染组：待细胞贴壁后，按照moi＝1感染hcv病毒)、hcv-mir-206组(在hcv病毒感染12h后，将mirna-206mimics转染至细胞中，转染5h后，更换新鲜培养基继续培养)。具体实验步骤如下：
[0093]
(1)将密度为5
×
103cells/ml细胞悬浮液以100μl/孔铺至96孔板中，按照上述实验分组分别对细胞进行处理。
[0094]
(2)按照上述设置的实验组进行处理。
[0095]
(3)处理好的细胞在转染后12h、24h、48h和72h使用cck-8(tren)试剂盒进行检测。结果见图2～图3。
[0096]
5、激光共聚焦验证mirna-206mimics转染实例
[0097]
(1)向6孔板中放置24mm的爬片，再将细胞悬液加入孔板中，细胞融合度达到60～70％后转染适量mir-206mimics，在转染48h后，弃去培养基用pbs洗3遍，每孔加入1ml的4％多聚甲醛固定半小时。
[0098]
(2)吸出多聚甲醛后，pbs洗3遍，每孔加入300μl的dapi(1：2000稀释)核染10min，避光操作。
[0099]
(3)将dapi弃去后，pbs洗3次。在载玻片上滴上一滴甘油，将爬片上细胞附着的一侧朝下放置在载玻片上，然后将爬片边缘固定好。
[0100]
(4)用激光共聚焦观察细胞荧光情况。结果见图4。
[0101]
6、hcv感染后瞬时转染mirna-206对hcv病毒增殖的实例
[0102]
(1)将密度为1
×
105cells/ml细胞悬浮液以1ml/孔铺至12孔板中，铺板12h后进行hcv病毒感染，按moi＝1接入病毒液，在感染12h后进行换液。
[0103]
(2)将mirna-206mimics转染至细胞中，转染5h后，更换新鲜培养基继续培养。
[0104]
(3)分别在转染后24h、48h和72h收集细胞与上清。
[0105]
(4)使用病毒rna提取试剂盒(tiangen)提取细胞和上清中的hcv病毒。
[0106]
(6)使用rr064a(takara)试剂盒检测hcv病毒载量(见图5)。hcv病毒载量检测的引物、荧光定量pcr反应体系及条件如表3～5所示。
[0107]
表3 hcv病毒载量荧光定量引物及taqman探针序列
[0108][0109]
表4 hcv病毒载量探针法荧光定量体系
[0110][0111]
表5 hcv病毒载量荧光定量pcr反应条件
[0112][0113]
7、蛋白免疫印迹验证
[0114]
(1)按照步骤6中处理细胞并将细胞收集起来，加入蛋白裂解液(ripa：pmsf＝1：1000)冰上裂解2h，于4℃12000rpm离心20min。
[0115]
(2)使用bca蛋白定量试剂盒(beyotime)对蛋白进行定量，向96孔板中加入100μl/孔的bca反应液再加入10μl/孔的标准品与样品，37℃孵育30min，孵育结束后，于a564处检测吸光度。绘制标准曲线曲并统一样品浓度。
[0116]
(3)变性：按30μg/管将样品蛋白进行分装，每管中加入6μl的5
×
loadingbuffer，用pbs补充至30μl，振荡混匀后98℃变性10min，-80℃冰箱保存备用。
[0117]
(4)电泳：配置5％的浓缩胶，12％的分离胶。浓缩胶按照90v电泳30min，分离胶按照110v电泳120min。
[0118]
(5)转膜：按照“阴极－海绵垫－四层滤纸－胶－膜－四层滤纸－海绵垫－阳极”的顺序放置，160ma恒流冰浴转印2h。
[0119]
(6)封闭：用5％脱脂奶封闭2h。
[0120]
(7)孵育一抗：弃去封闭液，pbst洗3次，10min/次，4℃过夜孵育一抗(β-actin为1：5000，hcv core protein为1：1000)。
[0121]
(8)孵育二抗：回收一抗，pbst洗3次，10min/次，二抗(1：10000)室温孵育1h。
[0122]
(9)显影：回收二抗，pbst洗膜3次，10min/次，之后将膜浸泡pbst中，于全自动化学发光图像分析仪下显影。结果见图6。
[0123]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。