壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及农药技术领域，更具体地，涉及噁霉灵和嘧霉胺技术领域，特别是指一种壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.噁霉灵，商品名为土菌消、绿佳宝等，化学名为3-羟基-5-甲基异恶唑，在酸、碱溶液中均稳定，是一种低毒、无残留的绿色内吸性农用杀菌剂，同时还可作为土壤消毒剂和植物生长调节剂。噁霉灵是广谱杀菌剂，对多种病原菌，包括对鞭毛菌、子囊菌、担子菌、腐霉菌、苗腐菌、镰刀菌以及丝核菌等，有较高的防治结果，因而广泛应用于农作物和蔬菜的枯萎病、立枯病、黄萎病、猝倒病、纹枯病、茎枯病、叶枯病以及连作重茬等病虫害防治领域。同时，其还具有促进作物根系生长发育、生根壮苗提高成活率的作用。
3.嘧霉胺，化学名n-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)苯胺，是一种苯氨基嘧啶类杀菌剂，在弱酸-弱碱性条件下稳定。其有内吸传导和熏蒸作用，施药后迅速达到植株的花、幼果等喷雾无法达到的部位杀死病菌。嘧霉胺与其他杀菌剂无交互抗性，而且在低温下使用，仍有非常好的保护和治疗效果，主要用于防治黄瓜、番茄、葡萄、草莓、豌豆、韭菜、等作物灰霉病、枯萎病以及果树黑星病、斑点落叶病等。
4.当前在实际应用中，噁霉灵和嘧霉胺主要以粉剂产品为主，在配制喷施液体过程中，粉剂容易飞扬，对人身和环境产生毒害。其次，嘧霉胺因为残留容易产生药害，且很多地区作物如番茄、油菜、黄瓜等对其产生了抗药性，因此加大农药使用量，从而对环境造成严重损害。
5.壳聚糖(chitosan)是甲壳素脱乙酰化的衍生物，是自然界中含量仅次于纤维素的第二大有机高分子化合物，也是自然界中唯一的阳离子碱性多糖。它富含大量的可修饰基团，如氨基、羟基、乙酰胺基以及自(1
→
4)糖苷键等。壳聚糖2位碳上自由氨基和6位碳上羟基，可进行如酰化、酯化、酰亚胺化、叠氮化、成盐、螯合、水解、氧化等反应，从而可以制备壳聚糖衍生物或偶联体。此外，它还具有良好的生物安全性和相容性、生物降解性、亲水性以及可再生性和抗菌性。因而，基于壳聚糖纳米颗粒药物载体系统的制备及其应用己成为材料科学和生物学交叉学科研究的热点，也必将为药物载体的选择和研究提供新的机遇。
6.因此，希望提供一种壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体，其可以增加噁霉灵和嘧霉胺的稳定性、持久性和协同性，从而降低农药的使用量，减少对环境和人类的潜在危害，产生客观的经济效益和环境效益。


技术实现要素：

7.为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体，其可以增加噁霉灵和嘧霉胺的稳定性、持久性和协同性，从而降低农药的使用量，减少对环境和人类的潜在危害，产生客观的经济效益和环境效益，适于大规模推广应用。
8.本发明的另一目的在于提供一种壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体的制备方法，其制备简便快捷，可操作性强，制备的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体可以增加噁霉灵和嘧霉胺的稳定性、持久性和协同性，从而降低农药的使用量，减少对环境和人类的潜在危害，产生客观的经济效益和环境效益，适于大规模推广应用。
9.本发明的另一目的在于提供一种壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体的应用，其可以应用于植物病害菌防治领域，抑制植物病害菌更强，从而降低农药的使用量，减少对环境和人类的潜在危害，产生客观的经济效益和环境效益，适于大规模推广应用。
10.为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体，其特点是，包括壳聚糖、噁霉灵、嘧霉胺、第一化学偶联剂和第二化学偶联剂，所述噁霉灵通过所述第一化学偶联剂化学偶联至所述壳聚糖，所述嘧霉胺通过所述第二化学偶联剂化学偶联至所述壳聚糖。
11.较佳地，所述第一化学偶联剂为第一酰氯化合物，所述第二化学偶联剂为第二酰氯化合物。
12.更佳地，所述第一酰氯化合物和所述第二酰氯化合物均选自氯乙酰氯、3-氯丙酰氯和4-(氯甲基)氯甲酰氯中的一种。
13.在本发明的第二方面，提供一种上述的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体的制备方法，其特点是，包括以下步骤：
14.(1)将所述噁霉灵和所述第一化学偶联剂反应得到噁霉灵化学偶联中间体；
15.(2)将所述嘧霉胺和所述第二化学偶联剂反应得到嘧霉胺化学偶联中间体；
16.(3)将所述噁霉灵化学偶联中间体和所述嘧霉胺化学偶联中间体均与所述壳聚糖反应，从而将所述噁霉灵通过所述第一化学偶联剂化学偶联至所述壳聚糖以及将所述嘧霉胺通过所述第二化学偶联剂化学偶联至所述壳聚糖。
17.较佳地，所述第一化学偶联剂为第一酰氯化合物，所述第二化学偶联剂为第二酰氯化合物，所述步骤(1)具体为：将所述噁霉灵和所述第一酰氯化合物反应得到噁霉灵酰氯中间体；所述步骤(2)具体为：将所述嘧霉胺和所述第二酰氯化合物反应得到嘧霉胺酰氯中间体；所述步骤(3)具体为：将所述噁霉灵酰氯中间体和所述嘧霉胺酰氯中间体均在碱性条件下与所述壳聚糖发生亲核取代反应，从而将所述噁霉灵通过所述第一酰氯化合物化学偶联至所述壳聚糖以及将所述嘧霉胺通过所述第二酰氯化合物化学偶联至所述壳聚糖。
18.更佳地，在所述步骤(1)中，所述噁霉灵和所述第一酰氯化合物的质量比为1：1.5～2.5；在所述步骤(2)中，所述嘧霉胺和所述第二酰氯化合物的质量比为1：1.5～2.5。
19.更佳地，所述步骤(1)进一步具体为：将所述噁霉灵溶解于第一溶剂中获得噁霉灵溶液，将所述第一酰氯化合物滴加到所述噁霉灵溶液中，然后加入第一缚酸剂，继续反应，反应结束后蒸干所述第一溶剂得到所述噁霉灵酰氯中间体；
20.所述步骤(2)进一步具体为：将所述嘧霉胺溶解于第二溶剂中获得嘧霉胺溶液，将所述第二酰氯化合物滴加到所述嘧霉胺溶液中，然后加入第二缚酸剂，接着反应，反应结束后蒸干所述第二溶剂得到所述嘧霉胺酰氯中间体；
21.所述步骤(3)进一步具体为：在所述壳聚糖中加入第三溶剂搅拌溶胀，然后加入碱液和亲核取代反应催化剂搅拌碱化，获得亲核取代反应液，将所述噁霉灵酰氯中间体和所述嘧霉胺酰氯中间体溶解于第四溶剂中，然后滴加至所述亲核取代反应液中进行所述亲核
取代反应。
22.更进一步地，所述第一溶剂、所述第二溶剂和所述第三溶剂均为二氯甲烷，所述第四溶剂为三氯甲烷，所述第一缚酸剂和所述第二缚酸剂均选自碳酸钾和碳酸钠中的一种，所述碱液为氢氧化钠溶液，所述亲核取代反应催化剂为4-甲氨基吡啶。
23.更进一步地，在所述步骤(1)和所述步骤(2)中，所述继续反应和所述接着反应均在冰浴条件下进行；在所述步骤(3)中，所述壳聚糖和所述第三溶剂的质量体积比为 0.08～0.15；所述搅拌溶胀的时间为0.5～1h；所述碱液和所述第三溶剂的体积比为0.15～0.25；所述碱液的浓度为10mol/l；所述搅拌碱化的时间为3h～6h；所述噁霉灵酰氯中间体和所述嘧霉胺酰氯中间体的质量总和与所述壳聚糖的质量的比值为0.4～0.8；所述噁霉灵酰氯中间体和所述嘧霉胺酰氯中间体的质量比为1～2：1～2；所述亲核取代反应的温度为40℃～60℃，所述亲核取代反应的时间为3h～6h。
24.在本发明的第三方面，提供上述的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体在植物病害菌防治中的应用。
25.本发明的有益效果在于：
26.a.本发明的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体包括壳聚糖、噁霉灵、嘧霉胺、第一化学偶联剂和第二化学偶联剂，噁霉灵通过第一化学偶联剂化学偶联至壳聚糖，嘧霉胺通过第二化学偶联剂化学偶联至壳聚糖，可以增加噁霉灵和嘧霉胺的稳定性、持久性和协同性，从而降低农药的使用量，减少对环境和人类的潜在危害，产生客观的经济效益和环境效益，适于大规模推广应用。
27.b.本发明的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体的制备方法包括：(1)将噁霉灵和第一化学偶联剂反应得到噁霉灵化学偶联中间体；(2)将嘧霉胺和第二化学偶联剂反应得到嘧霉胺化学偶联中间体；(3)将噁霉灵化学偶联中间体和嘧霉胺化学偶联中间体均与壳聚糖反应，从而将噁霉灵通过第一化学偶联剂化学偶联至壳聚糖以及将嘧霉胺通过第二化学偶联剂化学偶联至壳聚糖，制备简便快捷，可操作性强，制备的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体可以增加噁霉灵和嘧霉胺的稳定性、持久性和协同性，从而降低农药的使用量，减少对环境和人类的潜在危害，产生客观的经济效益和环境效益，适于大规模推广应用。
28.c.本发明的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体在植物病害菌防治中的应用，抑制植物病害菌更强，从而降低农药的使用量，减少对环境和人类的潜在危害，产生客观的经济效益和环境效益，适于大规模推广应用。
29.本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明得以充分体现，并可通过说明书中特地指出的方法、手段和它们的组合得以实现。
具体实施方式
30.为了降低农药使用量，且减少对环境的影响，本发明人提供一种壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体，包括壳聚糖、噁霉灵、嘧霉胺、第一化学偶联剂和第二化学偶联剂，所述噁霉灵通过所述第一化学偶联剂化学偶联至所述壳聚糖，所述嘧霉胺通过所述第二化学偶联剂化学偶联至所述壳聚糖。
31.所述壳聚糖可以是任何合适的壳聚糖，较佳地，所述壳聚糖的脱乙酰度≥85％，所
述壳聚糖的分子量50kd～200kd，所述壳聚糖的纯度≥95％。
32.所述第一化学偶联剂和所述第二化学偶联剂可以是任何合适的化学偶联剂，较佳地，所述第一化学偶联剂为第一酰氯化合物，所述第二化学偶联剂为第二酰氯化合物。
33.所述第一酰氯化合物和所述第二酰氯化合物可以是任何合适的酰氯化合物，更佳地，所述第一酰氯化合物和所述第二酰氯化合物均选自氯乙酰氯、3-氯丙酰氯和4-(氯甲基) 氯甲酰氯中的一种。
34.还提供一种上述的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体的制备方法，包括以下步骤：
35.(1)将所述噁霉灵和所述第一化学偶联剂反应得到噁霉灵化学偶联中间体；
36.(2)将所述嘧霉胺和所述第二化学偶联剂反应得到嘧霉胺化学偶联中间体；
37.(3)将所述噁霉灵化学偶联中间体和所述嘧霉胺化学偶联中间体均与所述壳聚糖反应，从而将所述噁霉灵通过所述第一化学偶联剂化学偶联至所述壳聚糖以及将所述嘧霉胺通过所述第二化学偶联剂化学偶联至所述壳聚糖。
38.依据不同的所述第一化学偶联剂和所述第二化学偶联剂，所述步骤(1)、所述步骤(2)和所述步骤(3)可以采用不同的具体步骤，较佳地，在所述第一化学偶联剂为第一酰氯化合物以及所述第二化学偶联剂为第二酰氯化合物的情况下，所述步骤(1)具体为：将所述噁霉灵和所述第一酰氯化合物反应得到噁霉灵酰氯中间体；所述步骤(2) 具体为：将所述嘧霉胺和所述第二酰氯化合物反应得到嘧霉胺酰氯中间体；所述步骤(3) 具体为：将所述噁霉灵酰氯中间体和所述嘧霉胺酰氯中间体均在碱性条件下与所述壳聚糖发生亲核取代反应，从而将所述噁霉灵通过所述第一酰氯化合物化学偶联至所述壳聚糖以及将所述嘧霉胺通过所述第二酰氯化合物化学偶联至所述壳聚糖。
39.在所述步骤(1)中，所述噁霉灵和所述第一酰氯化合物的质量比可以根据需要确定，更佳地，在所述步骤(1)中，所述噁霉灵和所述第一酰氯化合物的质量比为1：1.5～2.5。
40.在所述步骤(2)中，所述嘧霉胺和所述第二酰氯化合物的质量比可以根据需要确定，更佳地，在所述步骤(2)中，所述嘧霉胺和所述第二酰氯化合物的质量比为1：1.5～2.5。
41.所述步骤(1)、所述步骤(2)和所述步骤(3)可以进一步采用不同的具体步骤，更佳地，所述步骤(1)进一步具体为：将所述噁霉灵溶解于第一溶剂中获得噁霉灵溶液，将所述第一酰氯化合物滴加到所述噁霉灵溶液中，然后加入第一缚酸剂，继续反应，反应结束后蒸干所述第一溶剂得到所述噁霉灵酰氯中间体；
42.所述步骤(2)进一步具体为：将所述嘧霉胺溶解于第二溶剂中获得嘧霉胺溶液，将所述第二酰氯化合物滴加到所述嘧霉胺溶液中，然后加入第二缚酸剂，接着反应，反应结束后蒸干所述第二溶剂得到所述嘧霉胺酰氯中间体；
43.所述步骤(3)进一步具体为：在所述壳聚糖中加入第三溶剂搅拌溶胀，然后加入碱液和亲核取代反应催化剂搅拌碱化，获得亲核取代反应液，将所述噁霉灵酰氯中间体和所述嘧霉胺酰氯中间体溶解于第四溶剂中，然后滴加至所述亲核取代反应液中进行所述亲核取代反应。
44.所述第一溶剂、所述第二溶剂、所述第三溶剂和所述第四溶剂可以是任何合适的溶剂，所述第一缚酸剂和所述第二缚酸剂可以是任何合适的缚酸剂，所述碱液可以是任何合适的碱液，所述亲核取代反应催化剂可以是任何合适的催化剂，更进一步地，所述第一溶
剂、所述第二溶剂和所述第三溶剂均为二氯甲烷，所述第四溶剂为三氯甲烷，所述第一缚酸剂和所述第二缚酸剂均选自碳酸钾和碳酸钠中的一种，所述碱液为氢氧化钠溶液，所述亲核取代反应催化剂为4-甲氨基吡啶。
45.所述步骤(1)、所述步骤(2)和所述步骤(3)中的其它具体反应条件可以根据需要确定，更进一步地，在所述步骤(1)和所述步骤(2)中，所述继续反应和所述接着反应均在冰浴条件下进行；在所述步骤(3)中，所述壳聚糖和所述第三溶剂的质量体积比为0.08～0.15；所述搅拌溶胀的时间为0.5～1h；所述碱液和所述第三溶剂的体积比为 0.15～0.25；所述碱液的浓度为10mol/l；所述搅拌碱化的时间为3h～6h；所述噁霉灵酰氯中间体和所述嘧霉胺酰氯中间体的质量总和与所述壳聚糖的质量的比值为0.4～0.8；所述噁霉灵酰氯中间体和所述嘧霉胺酰氯中间体的质量比为1～2：1～2；所述亲核取代反应的温度为40℃～60℃，所述亲核取代反应的时间为3h～6h。
46.在所述步骤(3)之后，所述的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体的制备方法还可以包括其它任何合适的步骤，更进一步地，在所述步骤(3)之后，所述的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体的制备方法还包括：
47.(4)加入水，然后加酸调节ph至7，终止所述亲核取代反应，过滤得到固体反应物，用甲醇溶液洗涤，干燥得到产物，所得产物即为所述的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体。
48.所述水可以是任何合适的水，所述酸可以是任何合适的酸，所述水和所述第三溶剂的体积比、所述甲醇溶液的浓度和所述干燥的温度可以根据需要确定，尤其更佳地，所述水是蒸馏水，所述酸是乙酸，所述水和所述第三溶剂的体积比为0.1，所述甲醇溶液的质量浓度为70％～80％，所述干燥的温度为50℃～70℃。
49.还提供上述的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体在植物病害菌防治中的应用。
50.所述植物病害菌可以是任何合适的植物病害菌，较佳地，所述植物病害菌为苹果炭疽病菌、立枯丝核菌和黄瓜灰霉病菌。
51.为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
52.实施例1制备壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体a
53.称取5g噁霉灵(hml)(上海源叶生物科技有限公司，纯度：br，97％)加入100ml 二氯甲烷中，磁力搅拌直至噁霉灵溶解。然后称取10g氯乙酰氯，通过恒压漏斗缓慢滴加到上述反应体系中。氯乙酰氯滴加完毕后，向反应体系中加入碳酸钾作为缚酸剂，在冰浴条件下继续反应，通过薄层层析法检测反应进程。待反应结束后，向反应体系中加入碳酸钾水溶液，除去未反应的酰氯化合物。然后将反应混合体系倒入分液漏斗中静置，待体系分层后收集下层的有机相，并采用减压旋转蒸发仪蒸干溶剂得到噁霉灵氯乙酰氯中间体。
54.称取5g嘧霉胺(pml)(天津市施普乐农药技术发展有限公司，纯度：98％)加入 100ml二氯甲烷中，磁力搅拌直至嘧霉胺溶解。然后称取10g氯乙酰氯，通过恒压漏斗缓慢滴加到上述反应体系中。氯乙酰氯滴加完毕后，向反应体系中加入碳酸钾作为缚酸剂，在冰浴条件下继续反应，通过薄层层析法检测反应进程。待反应结束后，向反应体系中加入碳酸钾水溶液，除去未反应的酰氯化合物。然后将反应混合体系倒入分液漏斗中静置，待体系分层
后收集下层的有机相，并采用减压旋转蒸发仪蒸干溶剂得到嘧霉胺氯乙酰氯中间体。
55.称取10g壳聚糖(cs，脱乙酰度≥85％，mw为100kd左右，纯度≥95％)(青岛博智汇力生物科技有限公司)于反应容器中，然后缓慢加入体积100ml二氯甲烷，磁力搅拌溶胀1h。之后加入20ml的10mol/l氢氧化钠溶液和催化量的4-甲氨基吡啶搅拌碱化4h。然后称取噁霉灵氯乙酰氯中间体和嘧霉胺氯乙酰氯中间体各3g，溶解于三氯甲烷中。然后通过恒压漏斗缓慢滴加至含壳聚糖的反应体系中，添加完毕50℃水浴反应4h。反应结束时，向体系中加入10ml蒸馏水，加入乙酸调节ph至7，终止反应。过滤得到固体反应物，用80％质量浓度的甲醇溶液洗涤，60℃干燥得到产物cs-hml-pml，即壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体a。
56.本发明采用高效液相色谱法对噁霉灵和嘧霉胺对壳聚糖的接枝率进行测定。取0.1g 的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体a，在体积比(v/v)1:1的甲醇和乙腈混合溶液中，搅拌1.5h，确保噁霉灵和嘧霉胺从壳聚糖解析出来，然后采用以下条件进行检测：c18反相柱；波长205nm；流动相：水/乙腈/甲醇(v/v/v＝15:40:45)；流速：1.0ml/min；柱温： 30℃。
57.结果显示，噁霉灵和嘧霉胺对壳聚糖的接枝率分别为7.58％和8.08％。
58.实施例2制备壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体b
59.称取5g噁霉灵(hml)(上海源叶生物科技有限公司，纯度：br，97％)加入100ml 二氯甲烷中，磁力搅拌直至噁霉灵溶解。然后称取7.5g3-氯丙酰氯，通过恒压漏斗缓慢滴加到上述反应体系中。3-氯丙酰氯滴加完毕后，向反应体系中加入碳酸钠作为缚酸剂，在冰浴条件下继续反应，通过薄层层析法检测反应进程。待反应结束后，向反应体系中加入碳酸钠水溶液，除去未反应的酰氯化合物。然后将反应混合体系倒入分液漏斗中静置，待体系分层后收集下层的有机相，并采用减压旋转蒸发仪蒸干溶剂得到噁霉灵3-氯丙酰氯中间体。
60.称取5g嘧霉胺(pml)(天津市施普乐农药技术发展有限公司，纯度：98％)加入 100ml二氯甲烷中，磁力搅拌直至嘧霉胺溶解。然后称取7.5g3-氯丙酰氯，通过恒压漏斗缓慢滴加到上述反应体系中。3-氯丙酰氯滴加完毕后，向反应体系中加入碳酸钠作为缚酸剂，在冰浴条件下继续反应，通过薄层层析法检测反应进程。待反应结束后，向反应体系中加入碳酸钠水溶液，除去未反应的酰氯化合物。然后将反应混合体系倒入分液漏斗中静置，待体系分层后收集下层的有机相，并采用减压旋转蒸发仪蒸干溶剂得到嘧霉胺3-氯丙酰氯中间体。
61.称取8g壳聚糖(cs，脱乙酰度≥85％，mw为50kd左右，纯度≥95％)(青岛博智汇力生物科技有限公司)于反应容器中，然后缓慢加入体积100ml二氯甲烷，磁力搅拌溶胀0.75h。之后加入15ml的10mol/l氢氧化钠溶液和催化量的4-甲氨基吡啶搅拌碱化6h。然后称取噁霉灵3-氯丙酰氯中间体和嘧霉胺3-氯丙酰氯中间体各1.1g和2.2g，溶解于三氯甲烷中。然后通过恒压漏斗缓慢滴加至含壳聚糖的反应体系中，添加完毕60℃水浴反应 3h。反应结束时，向体系中加入10ml蒸馏水，加入乙酸调节ph至7，终止反应。过滤得到固体反应物，用70％质量浓度的甲醇溶液洗涤，70℃干燥得到产物cs-hml-pml，即壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体b。
62.本发明采用高效液相色谱法对噁霉灵和嘧霉胺对壳聚糖的接枝率进行测定。取0.1g 的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体b，在体积比(v/v)1:1的甲醇和乙腈混合溶液中，搅拌1.5h，确保噁霉灵和嘧霉胺从壳聚糖解析出来，然后采用以下条件进行检测：c18反
相柱；波长205nm；流动相：水/乙腈/甲醇(v/v/v＝15:40:45)；流速：1.0ml/min；柱温： 30℃。
63.结果显示，噁霉灵和嘧霉胺对壳聚糖的接枝率分别为9.07％和10.23％。
64.实施例3制备壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体c
65.称取5g噁霉灵(hml)(上海源叶生物科技有限公司，纯度：br，97％)加入100ml 二氯甲烷中，磁力搅拌直至噁霉灵溶解。然后称取12.5g4-(氯甲基)氯甲酰氯，通过恒压漏斗缓慢滴加到上述反应体系中。4-(氯甲基)氯甲酰氯滴加完毕后，向反应体系中加入碳酸钾作为缚酸剂，在冰浴条件下继续反应，通过薄层层析法检测反应进程。待反应结束后，向反应体系中加入碳酸钾水溶液，除去未反应的酰氯化合物。然后将反应混合体系倒入分液漏斗中静置，待体系分层后收集下层的有机相，并采用减压旋转蒸发仪蒸干溶剂得到噁霉灵4-(氯甲基)氯甲酰氯中间体。
66.称取5g嘧霉胺(pml)(天津市施普乐农药技术发展有限公司，纯度：98％)加入 100ml二氯甲烷中，磁力搅拌直至嘧霉胺溶解。然后称取12.5g4-(氯甲基)氯甲酰氯，通过恒压漏斗缓慢滴加到上述反应体系中。4-(氯甲基)氯甲酰氯滴加完毕后，向反应体系中加入碳酸钾作为缚酸剂，在冰浴条件下继续反应，通过薄层层析法检测反应进程。待反应结束后，向反应体系中加入碳酸钾水溶液，除去未反应的酰氯化合物。然后将反应混合体系倒入分液漏斗中静置，待体系分层后收集下层的有机相，并采用减压旋转蒸发仪蒸干溶剂得到嘧霉胺4-(氯甲基)氯甲酰氯中间体。
67.称取15g壳聚糖(cs，乙酰度≥85％，mw为200kd左右，纯度≥95％)(青岛博智汇力生物科技有限公司)于反应容器中，然后缓慢加入体积100ml二氯甲烷，磁力搅拌溶胀0.5h。之后加入25ml的10mol/l氢氧化钠溶液和催化量的4-甲氨基吡啶搅拌碱化3h。然后称取噁霉灵4-(氯甲基)氯甲酰氯中间体和嘧霉胺4-(氯甲基)氯甲酰氯中间体各8g 和4g，溶解于三氯甲烷中。然后通过恒压漏斗缓慢滴加至含壳聚糖的反应体系中，添加完毕40℃水浴反应6h。反应结束时，向体系中加入10ml蒸馏水，加入乙酸调节ph至7，终止反应。过滤得到固体反应物，用75％质量浓度的甲醇溶液洗涤，50℃干燥得到产物 cs-hml-pml，即壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体c。
68.本发明采用高效液相色谱法对噁霉灵和嘧霉胺对壳聚糖的接枝率进行测定。取0.1g 的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体c，在体积比(v/v)1:1的甲醇和乙腈混合溶液中，搅拌1.5h，确保噁霉灵和嘧霉胺从壳聚糖解析出来，然后采用以下条件进行检测：c18反相柱；波长205nm；流动相：水/乙腈/甲醇(v/v/v＝15:40:45)；流速：1.0ml/min；柱温： 30℃。
69.结果显示，噁霉灵和嘧霉胺对壳聚糖的接枝率分别为5.32％和6.56％。
70.实施例4壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体抑制苹果炭疽病菌实验
71.以壳聚糖cs、噁霉灵(hml)、嘧霉胺(pml)、噁霉灵与嘧霉胺混合物、壳聚糖与噁霉灵偶联体hml-cs(参考实施例1制备，不加嘧霉胺)、壳聚糖与嘧霉胺偶联体 pml-cs(参考实施例1制备，不加噁霉灵)、hml-cs与pml-cs混合物，以及壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体a～c为实验组，不加样品的培养基作为空白对照。将样品用 0.1％的tween-80水溶液溶解，然后加入50℃的pda培养基中，使每个实验组负载农药的终浓度为30mg/l，壳聚糖实验组与壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体a中壳聚糖含量一致，然后倒入培养皿中制备平
板。将预先培养的苹果炭疽病菌，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打成菌块，用接种针将菌块移至预先配制成的含药pda固体培养基和阴性对照pda固体培养基，每个培养皿3个菌饼，后置于30℃培养箱内培养3天。采用十字交叉法测定菌落直径，求取平均值，依据下式计算抑菌率(％)：
[0072][0073]
抑菌结果如表1所示，壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体a～c对苹果炭疽病菌生长的抑制效果最好，明显优于单独农药使用、农药混合使用、壳聚糖与单一农药偶联体以及壳聚糖与单一农药偶联体的混合物。导致壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体药效显著增加的原因可能有：1.噁霉灵和嘧霉胺对病原菌繁殖的抑制路径不一样，两者同时偶联壳聚糖起到了药效协同性效果；2.噁霉灵和嘧霉胺同时与壳聚糖偶联，破坏了壳聚糖分子间的氢键，增加了壳聚糖的溶解性，改善了壳聚糖大分子构象；3.壳聚糖增强了噁霉灵和嘧霉胺的稳定性，同时对农药进行缓释，增强了药效的持久性。因此，壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体因其高效药性而具有潜在的经济效益和环境效益。
[0074]
表1.样品对苹果炭疽病菌的抑制作用
[0075][0076]
*1:只含壳聚糖的实验组含量与cs-hml-pml a壳聚糖含量一致；
[0077]
*2：此实验组壳聚糖负载的hml和pml含量与cs-hml-pml a负载农药含量分别一致。
[0078]
实施例5壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体抑制立枯丝核菌生长实验
[0079]
除病原菌对象为立枯丝核菌外，本实施例与实施例4方法完全一致，具体实验和分
析方法参考实施例4。
[0080]
样品对立枯丝核菌抑菌结果如表2所示，壳聚糖与嘧霉胺偶联体pml-cs和嘧霉胺原药相比，药效提高约26％。而壳聚糖与噁霉灵偶联体hml-cs与噁霉灵原药相比，药效有所降低。同时，cs-hml和cs-pml混合物也未能提高药效。但是，壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体a～c显著提高了农药原药的药效，抑制率最高，超过61％。其原因可能主要由于噁霉灵和嘧霉胺同时与壳聚糖偶联，破坏了壳聚糖分子间的氢键，增加了壳聚糖的溶解性和大分子构象，同时改善噁霉灵和嘧霉胺的稳定性和药效的持久性。因此，壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体因其高效药性而具有潜在的经济效益和环境效益。
[0081]
表2.样品对立枯丝核菌抑制作用
[0082][0083]
*1:只含壳聚糖的实验组含量与cs-hml-pmla壳聚糖含量一致；
[0084]
*2：此实验组壳聚糖负载的hml和pml含量与cs-hml-pml a负载农药含量分别一致。
[0085]
实施例6壳聚糖与农药共价偶联体抑制黄瓜灰霉病实验
[0086]
选取长势一致三叶期的33棵黄瓜幼苗(共11处理，每个处理3个重复)为实验对象。将灰葡萄孢病原菌活化，接种于含有玻璃纸的pda平板上28℃培养2d，收集菌丝(约1.5 g)后将其搅拌磨碎，接种于含有250ml pdb培养基的1l三角摇瓶中，28℃和120r/min 条件下恒温振荡培养7d，采用4层灭菌纱布过滤，得到分生孢子悬浮液(1
×
106conidia/ml)。分别配置浓度为20mg/l的壳聚糖cs、噁霉灵hml、嘧霉胺pml、噁霉灵与嘧霉胺混合物、壳聚糖与噁霉灵偶联体hml-cs、壳聚糖与嘧霉胺偶联体pml-cs、hml-cs与pml-cs 混合物，以及壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体a～c，同时不加样品的水溶液为空白对照，对黄瓜幼苗进行喷施，每颗喷施15ml。喷施样品1d后，将制备的灰霉病孢子悬浮液用于均匀喷雾叶片，喷
到不滴水为宜，接种15d后调查发病情况。
[0087]
炭疽病分级标准：
[0088]
0级：叶片健康无病；
[0089]
1级：1-25％叶片面积发病；
[0090]
2级：26-50％叶片面积发病；
[0091]
3级：51-75％叶片面积发病；
[0092]
4级：76％以上面积叶片黄化溃烂；
[0093]
根据下列公式计算：
[0094][0095][0096]
结果如表3显示，壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体a～c对黄瓜灰霉病抑制率最好，防治率达到65％左右。其主要原因可能为噁霉灵和嘧霉胺药物在壳聚糖载体上协同性增强导致，同时壳聚糖对农药起到了稳定和缓释的作用，延长了药物的作用效果。因此，壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体因其高效药性而具有潜在的经济效益和环境效益。
[0097]
表3.样品对黄瓜灰霉病防治效果
[0098][0099][0100]
*1:只含壳聚糖的实验组含量与cs-hml-pml a壳聚糖含量一致；
[0101]
*2：此实验组壳聚糖负载的hml和pml含量与cs-hml-pml a负载农药含量分别一致。
[0102]
因此，本发明将恶霉灵和嘧霉胺通过化学反应方法偶联到壳聚糖大分子上，优选
地，将噁霉灵和嘧霉胺先分别与酰氯化合物反应获得噁霉灵酰氯衍生物和嘧霉胺酰氯衍生物，然后两者共同在碱性条件下与壳聚糖发生亲核取代反应，制备得到壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体。与单一农药原药、农药原药混合物、壳聚糖与单一农药偶联体以及壳聚糖与单一农药偶联体的混合物相比，壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体显著增加恶霉灵和嘧霉胺药效的协同性以及稳定性以及药效持久性，一定用量下抑制植物病害菌更强，从而最大限度减少农药原药使用量，减少对环境和人类的潜在危害，产生客观的经济效益和环境效益。
[0103]
综上所述，本发明的壳聚糖与噁霉灵和嘧霉胺共价偶联体可以增加噁霉灵和嘧霉胺的稳定性、持久性和协同性，从而降低农药的使用量，减少对环境和人类的潜在危害，产生客观的经济效益和环境效益，适于大规模推广应用。
[0104]
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。