一种二氧化硅支架组合物及利用其扩增人TIL的方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种基于功能化的二氧化硅支架组合物及利用其扩增人til的方法。

背景技术：

1、基于肿瘤浸润淋巴细胞(til)的过继性细胞疗法(act)是指从手术切除的患者肿瘤组织中分离til，til在体外扩增到一定数量后回输到患者体内从而杀伤肿瘤细胞，引起宿主抗肿瘤免疫应答的一种免疫疗法。til的扩增培养体系发展至今为止趋于成熟，主要分为两个阶段。在第一阶段，从患者切除的肿瘤标本剪碎成2-5mm3大小的切块或消化成肿瘤细胞悬液，在含高剂量il-2(3000iu/ml-6000iu/ml)的培养基中扩增培养，第10-18天后，淋巴细胞过度增长，肿瘤细胞大量凋亡从而得到较纯的til细胞群。第一阶段所产生的til在过量辐照的同种异体外周血单个核细胞(pbmc)、针对t细胞受体的抗cd3抗体(30ng/ml)和高剂量il-2(3000iu/ml-6000iu/ml)的条件下进入快速扩增阶段(rep)。在14天的培养期内，til会扩增至1000-2000倍。通过这种方法，可以收获多达2×1011个til以供患者输注。

2、然而，传统的til扩增方案有一定的局限性。首先，til在体外扩增时需一直处于高剂量il-2的条件下扩增，而这会引起til的衰竭和凋亡，杀瘤活性难以持续。其次，til临床回输量大，一般临床上需要回输1011个til才能达到临床效果。再者，不同的肿瘤患者尤其是不同疾病进展期的患者中提取的til活性差异大，til的扩增周期和扩增效果可变性高，不可控因素难以把握。最后，til中存在大量无法识别肿瘤抗原的t细胞，回输产品中有效杀瘤成分低。

3、因此，需要开发一种新型的til培养工艺从三个方面进行优化，第一，降低til对il-2的依赖，减少til的衰竭和凋亡。第二，高效富集有效杀瘤成分从而降低回输用量。第三，提高记忆型til的产率，以期促进细胞效应的长期存续。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中人肿瘤浸润淋巴细胞(til)体外扩增时依赖il-2、容易衰竭和凋亡、很难富集有效杀瘤成分、til的抗瘤活性及体内存续能力低等问题，本发明公开了一种基于功能化的二氧化硅支架组合物及利用其扩增人til的方法。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种功能化的二氧化硅支架组合物，所述二氧化硅支架组合物包括：(1)介孔二氧化硅微粒；(2)细胞因子组合，包含选自il-2、il-7、il-15、il-21等γ链细胞因子中的两种或两种以上的细胞因子。

3、具体地，所述细胞因子组合包含选自il-2、il-7、il-15和il-21中的两种或两种以上的细胞因子。

4、介孔二氧化硅微粒可高吸附各种细胞因子，il-2等细胞因子随着支架的降解逐渐释放，避免til因高剂量il-2等细胞因子的刺激下引起的衰竭及凋亡。为提高活性til的扩增效率及产量，il-7等细胞因子的补充能大幅降低til对il-2的依赖，提高记忆型til的产率，促进细胞的长期存续。即，二氧化硅微粒细胞因子缓释体系既可降低til对il-2的依赖性同时提高til的扩增效率，又能在原有技术基础上增强til的杀瘤活性及记忆性能从而高效富集有效成分。

5、如本发明技术方案之一所述的二氧化硅支架组合物，所述细胞因子组合包含选自il-2、il-7、il-15和il-21中的三种细胞因子。

6、在本发明的较佳实施方案中，所述细胞因子组合包含细胞因子il-2、il-7和il-15。

7、为更大程度地优化支架扩增til的效果，已装载细胞因子的二氧化硅微棒按固定比例混合。

8、在本发明的更佳实施方案中，所述细胞因子组合中各细胞因子的质量比为il-2:il-7:il-15＝1:(0.05～0.3):(0.05～0.3)，优选il-2:il-7:il-15＝1:(0.1～0.3):(0.1～0.3)。

9、在本发明的具体实施方案中，所述细胞因子组合中各细胞因子的质量比为il-2:il-7:il-15＝1:0.1:0.1。

10、如本发明技术方案之一所述的二氧化硅支架组合物，所述细胞因子组合包含il-2、il-7、il-15和il-21四种细胞因子。

11、在本发明的较佳实施方案中，所述细胞因子组合中各细胞因子的质量比为il-2:il-7:il-15:il-21＝1:(0.05～0.5):(0.05～0.5):(0.1～1)。

12、在本发明的更佳实施方案中，所述细胞因子组合中各细胞因子的质量比为il-2:il-7:il-15:il-21＝1:(0.1～0.3):(0.1～0.3):(0.1～0.5)。在该比例的缓释条件下，扩增所得的til杀瘤活性最佳且存续能力最好。

13、在本发明的具体实施方案中，所述细胞因子组合中各细胞因子的质量比为il-2:il-7:il-15:il-21＝1:0.1:0.1:0.5。

14、为增强二氧化硅缓释细胞因子性能，减少二氧化硅表面刚性对细胞的损伤，本发明拟构建脂质体用于包裹二氧化硅微棒。

15、如本发明技术方案之一所述的二氧化硅支架组合物，所述二氧化硅支架组合物表面还包裹了脂质体。

16、在本发明的较佳实施方案中，所述二氧化硅支架组合物与脂质体的质量比为1:0.8～1:1.2，优选1:1。

17、所述脂质体可为本领域常规，在本发明的更佳实施方案中，所述脂质体选自popc和cap pe。

18、脂质体组成成分与细胞膜高度相似，其中，popc为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-pc，16:0-18:1pc，分子质量为760.076)是生物膜的主要成分，cap pe是一种生物素化磷脂(biotinyl-cap pe，分子质量为1105.484)。

19、在本发明的进一步更佳实施方案中，popc:cap pe的摩尔比为1000:1～1100:1。

20、在本发明的具体实施方案中，popc:cap pe的摩尔比为1010:1。

21、经脂质体包裹后，二氧化硅的表面刚性明显下降，且il-2等细胞因子的装载量提高30-40％。细胞因子最大负载量分别为，il-2:30％～60％、il-7:40％～50％、il-15:45％～65％、il-21:45％～55％。

22、如本发明技术方案之一所述的二氧化硅支架组合物，所述介孔二氧化硅微粒为sba-15型介孔分子筛，和/或，所述介孔二氧化硅微粒为直棒状结构。

23、在本发明的优选实施方案中，所述介孔二氧化硅微粒的棒长为70±40μm，棒宽为4±2.5μm，中孔大小为3±2.5nm，例如棒长为70.43±31.66μm。

24、支架在培养基中随机堆叠及沉积以形成3d培养体系，til能较好地黏附在支架表面并聚集成团从而促进t细胞克隆形成。直棒状结构的支架更易于在培养基中随机堆叠及沉积以形成3d培养体系，使til能更好地黏附在相应棒长的支架表面并聚集成团从而促进t细胞克隆形成。

25、如本发明技术方案之一所述的二氧化硅支架组合物，所述介孔二氧化硅微粒在吸附细胞因子之前，需要去除模板剂。

26、常规的sba-15型介孔分子筛合成路线中，去除模板剂的方式为马弗炉煅烧，然而经实验验证，马弗炉煅烧后的二氧化硅支架在培养基中难以降解，故在本发明中，对二氧化硅支架的合成方法作针对性的改进，本发明所述去除模板剂的方法优选化学萃取法。

27、在本发明的较佳实施方案中，所述化学萃取法为使用盐酸-乙醇溶液进行萃取。

28、在本发明的更佳实施方案中，所述盐酸-乙醇溶液为在无水乙醇中加入质量分数为37％的浓盐酸，所述浓盐酸与所述无水乙醇的体积比为1:(150～200)。

29、如本发明技术方案之一所述的二氧化硅支架组合物，所述萃取的方法为在温度为65℃～75℃、转速为500～700r.p.m.的条件下，用所述盐酸-乙醇溶液处理所述二氧化硅微粒，搅拌时间为22～26h。

30、所述温度优选70℃；所述转速优选600r.p.m.；所述浓盐酸与所述无水乙醇的体积比优选1:100；所述搅拌时间优选24h。

31、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种如技术方案之一所述二氧化硅支架组合物的制备方法，所述制备方法包含：

32、(1)用所述介孔二氧化硅微粒分别吸附细胞因子il-2、il-7、il-15和il-21，制得装载不同细胞因子的二氧化硅支架。

33、(2)按照如技术方案之一所述二氧化硅支架组合物中所定义的细胞因子的质量比混合所述装载不同细胞因子的二氧化硅支架，制得所述二氧化硅支架组合物。

34、在本发明的具体实施方案中，所述制备方法的步骤为：合成二氧化硅微棒并装载细胞因子(il-2、il-7、il-15、il-21)，接着将已装载不同细胞因子的支架按一定比例混合，然后在微棒表面包裹脂质体进一步优化支架缓释能力。

35、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法，所述方法包括：使用如技术方案之一所述的二氧化硅支架组合物扩增肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞。

36、如本发明技术方案之三所述的方法，所述肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞的获取方法为：从肿瘤组织中提取肿瘤浸润淋巴细胞，并筛选肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞。

37、在本发明的较佳实施方案中，所述筛选肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞为根据ifn-γ的分泌水平进行筛选；和/或，所述筛选为elisa方法。

38、在本发明的更佳实施方案中，所述ifn-γ的分泌水平的判断标准为：筛选ifn-γ释放量大于200pg/ml的肿瘤浸润淋巴细胞。

39、如本发明技术方案之三所述的方法，所述方法还包括分析不同肿瘤组织中cd4/cd8的平衡比率和/或记忆性til的比例，根据分析结果，在如技术方案之一所述的二氧化硅支架组合物的各细胞因子的质量比的范围内，调整所述各细胞因子的质量比的比例。

40、在本发明的较佳实施方案中，当所述肿瘤组织的cd4/cd8的平衡比率≥1.2时，所述各细胞因子的质量比为il-2:il-7:il-15:il-21＝1:(0.2～0.3):(0.2～0.3):(0.1～0.5)，优选il-2:il-7:il-15:il-21＝1:0.2:0.3:(0.1～0.5)。

41、当所述肿瘤组织的记忆性til比例≤50％时，所述各细胞因子的质量比为il-2:il-7:il-15:il-21＝1:(0.1～0.3):(0.1～0.3):(0.4～0.5)。

42、如本发明技术方案之三所述的方法，所述肿瘤浸润淋巴细胞取自人癌症患者，所述癌症为胃癌、胰腺癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、肝癌或肺癌；

43、在本发明的优选实施方案中，所述癌症为胰腺癌或肾癌。

44、本发明的二氧化硅支架装载细胞因子il-2、il-7、il-15、il-21等，其特点为二氧化硅支架中细胞因子具有缓慢释放特性(缓释体系：二氧化硅表面包裹脂质体，形成脂质双层，其中，脂质体的组成高度模拟细胞膜，能最大程度减缓支架刚性带来的细胞损伤)。il-2、il-7、il-15、il-21等细胞因子为定量组合，其功能为：降低til对il-2的依赖、增强til扩增能力、提高cd8+til及记忆性til的产率。

45、本发明的具体技术方案如下：

46、1、制备适用于细胞培养的二氧化硅微棒材料，sba-15型介孔分子筛，棒长70±40μm，宽4±2.5μm，中孔大小3±2.5nm。

47、2、合成的二氧化硅微棒分别装载til扩增所需细胞因子il-2、il-7、il-15、il-21等γ链细胞因子，混合比例为il-2:il-7:il-15:il-21＝1:(0.1～0.3):(0.1～0.3):(0.1～0.5)。针对不同的患者，分析不同患者肿瘤组织中cd4/cd8的平衡比率、记忆性til的占比，在上述组方的配比范围内略微调整最优比例。

48、最优比例的调整的方式为：

49、当cd8:cd4≥1.2时，il-2:il-7:il-15:il-21＝1:(0.2～0.3):(0.2～0.3):(0.1～0.5)，例如添加的il-2为1μg，则il-7、il-15的量分别应≥0.2μg。优选il-7:il-15＝1:1.5，即il-2:il-7:il-15:il-21＝1:0.2:0.3:(0.1～0.5)。

50、当记忆性til比例≤50％时，则il-2:il-7:il-15:il-21＝1:(0.1～0.3):(0.1～0.3):(0.4～0.5)，例如添加的il-2为1μg，则il-21的量应≥0.4μg。

51、3、以popc、cap pe为脂质体原材料用于脂质体的制备，popc与cap pe按popc:cappe的摩尔比为1000:1～1100:1的比例经旋转蒸发得到脂质体薄膜，接着添加pbs进行超声混匀，通过物理挤压得到尺寸均一的脂质体。

52、4、已装载细胞因子的功能化的二氧化硅支架组合物与脂质体以1:1的质量比在室温下混合1h，得到表面包裹脂质双层的二氧化硅支架。

53、5、从患者切除的肿瘤标本剪碎成2-5mm3大小的切块或消化成肿瘤细胞悬液，在含高剂量il-2(3000iu/ml-6000iu/ml)的til完全培养基中扩增培养，14天后收获所得的til通过elisa试剂盒检测各孔中ifn-γ分泌水平评估til的杀伤能力，ifn-γ释放量大于200pg/ml，则til被定义为具有肿瘤反应性til。本发明所用til完全培养基可为本领域常规。

54、6、肿瘤反应性til在二氧化硅微棒细胞因子缓释体系的作用下扩增培养，培养5-7天后70-80％的支架开始降解，培养7-10天后细胞因子的缓释达到最大量，培养14天后经离心可分离残余支架，收获til。

55、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

56、本发明所用试剂和原料均市售可得。

57、本发明的积极进步效果在于：

58、本发明基于til疗法对til的体外扩增培养体系作进一步优化，即开发一种新型二氧化硅支架负载适用于til扩增的细胞因子(il-2、il-7、il-15、il-21)以提高til产品的疗效，为临床应用提供技术指导。

59、同现有技术相比，用本发明提供的功能化的二氧化硅支架组合物扩增til，效率高、成本低、扩增效果好，无毒副作用，til中有效杀瘤成分及活性显著提高，记忆型til的产率高，能够使细胞效应长期存续，更适合推广临床应用。

60、本发明提供的用于扩增til的功能化的二氧化硅支架组合物中的细胞因子质量比的组方:il-2:il-7:il-15:il-21＝1:(0.1～0.3):(0.1～0.3):(0.1～0.5)，针对不同的患者可实现til的个体化扩增，可调节性强，能够满足各癌种til的大量高效扩增。