一种猪瘟病毒E0截短蛋白、制备方法及应用

一种猪瘟病毒e0截短蛋白、制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒e0截短蛋白、制备方法及应用。


背景技术：

2.猪瘟(classical swine fever，csf)又称猪霍乱(hogcholera，hc)是由猪瘟病毒(hog cholera virus，hcv或classical swine fever virus，csfv)引起的一种急性热性致死性疾病，猪瘟具有高度接触传染性，流行广泛，发病与死亡率高，危害极大。国际兽疫局(oie)以前将其定为a类传染病，现将期列为通报疫病，我国将其列为一类动物疫病。
3.csfv为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40-60nm。病毒基因组为单股正链rna，长约12.3kb，含一个大的开放性阅读框(orf)，编码一个含3898个氨基酸残基的多聚蛋白，分子量约为438kd。多聚蛋白在翻译的同时和翻译后经病毒和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白，其多聚蛋白上从n到c端的顺序依次为：n
pro
、c、e0(e
rns
)、e1、e2、p7、ns2-3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b。ns2-3可被加工成ns2、ns3(p80)，除c、e0、e1和e2为结构蛋白外.其余均为非结构蛋白。结构蛋白的加工是由宿主细胞的信号肽酶介导进行的，蛋白酶首先在核衣壳蛋白c和e012前体之间剪切多聚蛋白，随后在e2的c端剪切开，最后e012被迅速剪切成e01和e2。在e2从e012前体释放以后，e01被加工成e0和e1，最后这3种囊膜糖蛋白通过分子内或分子间二硫键形成复合物，组装成病毒粒子结构。
4.目前采取以预防为主的综合防控策略防控猪瘟，其中灭活疫苗是猪瘟田间毒株经病毒培养系统大量扩增、灭活、乳化等工艺制成，但是，传统的灭活疫苗存在免疫持续期短，在生产制备过程中还存在因病毒灭活不彻底而散毒的风险、生产成本较高等问题。基于此，研究者长期致力于csf亚单位疫苗的研发。e0蛋白能够诱导机体产生病毒中和性抗体，是csfv的重要保护性抗原，也是csf亚单位疫苗研制的候选抗原。e0蛋白的氨基酸序列中存在多个糖基化位点，对于保持其抗原性具有重要作用。通过原核大肠杆菌对e0进行制备时，产物以不可溶的包涵体形式存在，且缺乏糖基化修饰，严重影响了抗原蛋白的免疫原性；通过具有完备糖基化修饰功能的真核cho细胞对e0进行制备时，目标蛋白不表达或表达量极低，以上情况严重阻碍了csf亚单位疫苗的研发。


技术实现要素：

5.为了解决csfv e0在cho细胞中表达量低或不表达的技术问题，本发明经过大量研究发现，将csfv e0蛋白进行截短获得的csfv e0蛋白片段能够在cho细胞中进行大量表达，且不影响其免疫原性，可用于csf亚单位疫苗的制备，具体包括以下内容：
6.第一方面，本发明提供了一种猪瘟病毒e0截短蛋白，所述猪瘟病毒e0截短蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.第二方面，本发明提供了一种编码上述第一方面所述猪瘟病毒e0截短蛋白的基因序列，所述基因序列如seq id no.2所示。
8.第三方面，本发明提供了一种猪瘟病毒e0截短蛋白，将上述第一方面所述猪瘟病
毒e0截短蛋白的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸g；所述突变后的猪瘟病毒e0截短蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
9.第四方面，本发明提供了一种编码上述第三方面所述猪瘟病毒e0截短蛋白的基因序列，其特征在于，所述基因序列如seq id no.4所示。
10.第五方面，本发明提供了一种上述第一方面和第三方面所述的猪瘟病毒e0截短蛋白在制备猪瘟疫苗中的应用。
11.优选地，所述疫苗为亚单位疫苗。
12.第六方面，本发明提供了一种上述第一方面和第三方面所述的猪瘟病毒e0截短蛋白的制备方法，所述方法包括：将编码猪瘟病毒e0截短蛋白的基因克隆到真核表达载体中，得到表达猪瘟病毒e0截短蛋白的重组质粒；再将所述的重组质粒转染至cho细胞中，培养、筛选、纯化得到猪瘟病毒e0截短蛋白。
13.优选地，所述真核表达载体为pcdna3.1载体。
14.优选地，所述cho细胞为cho悬浮细胞。
15.优选地，所述方法为：
16.(1)pcr扩增编码猪瘟病毒e0截短蛋白的基因片段，所述基因片段如seq id no.2或seq id no.4所示；
17.(2)用限制性内切酶xho i、hind iii分别对载体pcdna3.1和猪瘟病毒e0截短蛋白的基因片段进行双酶切，并将酶切片段用dna连接酶连接，获得表达猪瘟病毒e0截短蛋白的重组质粒pcdna3.1-csfv-te0截短；
18.(3)将重组质粒pcdna3.1-csfv-te0截短转染cho悬浮细胞，悬浮培养，收集细胞培养上清，纯化即得猪瘟病毒e0截短蛋白。
19.本发明的有益效果是：
①
通过原核大肠杆菌对猪瘟病毒e0蛋白进行制备时，产物以不可溶的包涵体形式存在，且缺乏糖基化修饰，严重影响了抗原蛋白的免疫原性；通过具有完备糖基化修饰功能的真核cho细胞对猪瘟病毒e0蛋白进行制备时，目标蛋白不表达或表达量极低，以上情况严重阻碍了csf亚单位疫苗的研发；而本发明意外发现，将猪瘟病毒e0蛋白截短获得的e0蛋白片段不仅能够在cho细胞中大量分泌表达，蛋白产量高达0.38mg/ml；而且不影响e0蛋白的免疫原性，可用于csf亚单位疫苗的制备；
②
在上述截短表达的猪瘟病毒e0蛋白片段的基础上，本发明发现，将猪瘟病毒e0截短蛋白的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸g后，进一步促进了猪瘟病毒e0截短蛋白的表达，蛋白表达量提升30％以上，且不影响其免疫原性。
附图说明
20.图1猪瘟病毒e0蛋白、e0截短蛋白、氨基酸突变的e0截短蛋白表达结果；
21.图2猪瘟病毒e0截短蛋白的纯化结果；
22.图3猪瘟病毒氨基酸突变的e0截短蛋白的纯化结果；
23.图4间接elisa对猪瘟病毒e0截短蛋白免疫兔血清抗体检测结果；
24.图5间接elisa对猪瘟病毒氨基酸突变的e0截短蛋白免疫兔血清抗体检测结果。
具体实施方式
25.以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
26.以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：
27.中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(bsl-3)和猪瘟病相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
28.csfv疫苗标准株(购自中国兽医药品监察所-中国兽医微生物菌种保藏管理中心)、真核表达载体pcdna3.1(+)、csfv阳性血清由本实验室保存。cho悬浮细胞表达系统、unstained protein mw marker(26610)、rt-pcr扩增试剂盒、6
×
his tag monoclonal antibody(his.h8)、unstained protein mw marker(26616)及bca蛋白定量试剂盒、alexa488标记的羊抗兔二抗均购自thermo fisher scientific公司。镍亲和层析柱购自ge公司。rna提取试剂盒和dna凝胶纯化回收试剂盒均购自omega有限公司。xho i和hind iii限制性内切酶购自new england biolabs(neb)公司。大肠杆菌dh5α感受态细胞购自全式金公司。大量质粒提取试剂盒购自macherey-nagel公司。ecl显色液购自上海碧云天生物技术有限公司。截流分子量为8000-10000道尔顿的md44透析袋购自北京索莱宝科技有限公司。
29.术语“载体”是指可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等。
30.术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的亚单位疫苗。
31.本发明的疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、bcc、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质d、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。
32.本发明的疫苗也可用于联合疫苗，如与猪或牛的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗，三价苗等。
33.本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和阴道等途径。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。
34.实施例1猪瘟病毒e0截短蛋白及氨基酸突变的e0截短蛋白的制备
35.1.e0蛋白的基因片段扩增
36.由北京六合华大基因科技有限公司合成编码猪瘟病毒e0蛋白、e0截短蛋白、氨基
酸突变的e0截短蛋白的基因片段，并经核酸凝胶电泳鉴定正确。其中编码猪瘟病毒e0蛋白的基因片段如seq id no.6所示，氨基酸序列如seq id no.5所示；编码猪瘟病毒e0截短蛋白的基因片段如seq id no.2所示，氨基酸序列如seq id no.1所示；编码氨基酸突变的猪瘟病毒e0截短蛋白的基因片段如seq id no.4所示，氨基酸序列如seq id no.3所示；其中，氨基酸突变的猪瘟病毒e0截短蛋白指将猪瘟病毒e0截短蛋白的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸g。
37.2.表达质粒的构建与鉴定
38.pcdna3.1载体用限制性内切酶xho i、hind iii双酶切，切胶回收纯化载体片段；同时将合成的e0蛋白、e0截短蛋白、氨基酸突变的e0截短蛋白的基因片段分别用限制性内切酶xho i、hind iii双酶切并回收纯化，再分别将纯化回收的基因片段与纯化的pcdna3.1载体片段通过t4 dna连接酶连接，程序为16℃，12h，连接产物分别转化dh5α感受态细胞，挑取单菌落增菌培养，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，重组质粒分别命名为pcdna3.1-csfv-e0、pcdna3.1-csfv-te0、pcdna3.1-csfv-me0；重组质粒用xho i、hind iii进行双酶切鉴定，双酶切鉴定正确的重组质粒进行测序鉴定，确定目的基因序列的正确插入，确保阅读框完全正确。
39.构建的重组表达质粒pcdna3.1-csfv-e0、pcdna3.1-csfv-te0(e0截短蛋白)、pcdna3.1-csfv-me0(e0截短突变蛋白)经xho i和hind iii双酶切后，酶切产物大小与理论值相符，表明扩增的e0蛋白、e0截短蛋白和氨基酸突变的e0截短蛋白等基因片段与载体正确连接，基因测序结果也显示目的片段成功插入表达载体中。
40.3.蛋白的表达与纯化
41.参照expicho表达系统试剂盒说明书，将3种重组表达质粒分别转染cho悬浮细胞，转染的细胞于32℃、5％co2、湿度90％条件下继续悬浮培养12天后，4000g离心10min收集细胞培养上清进行sds-page鉴定。离心收集的细胞培养上清，经0.22μm滤膜过滤后，依照ge公司镍亲和层析柱说明书进行纯化。sds-page鉴定纯化后的目标蛋白，并使用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
42.离心收取3种转染重组表达质粒的细胞培养上清液，进行sds-page鉴定，结果如图1所示，转染pcdna3.1-csfv-e0质粒的细胞培养上清在30kd左右未观察到特异性目标蛋白条带，表明e0蛋白基本无表达；而转染pcdna3.1-csfv-te0质粒和pcdna3.1-csfv-me0质粒的细胞培养上清在30kd左右均观察到特异性目标蛋白条带，表明e0截短蛋白以及氨基酸突变的e0截短蛋白均能够正常表达。
43.使用镍亲和层析柱对表达的e0截短蛋白和氨基酸突变的e0截短蛋白进行纯化，洗脱蛋白样品经sds-page鉴定，结果如图2和图3所示：在30kd左右位置处观察到特异性目标蛋白条带，与细胞上清鉴定结果相符。使用bca蛋白定量试剂盒测定纯化后e0截短蛋白的浓度，计算单位培养体积中分泌表达的目标蛋白量，e0截短蛋白表达量约为0.38mg/ml，氨基酸突变的e0截短蛋白表达量约为0.51mg/ml。
44.实施例2免疫原性检测
45.采用间接elisa对e0截短蛋白和氨基酸突变的e0截短蛋白免疫兔血清进行检测，分析其免疫原性。用50mm碳酸盐缓冲液将纯化的2种目标蛋白(50ng/孔)分别包被于elisa酶标板中，4℃孵育过夜。用1％牛血清白蛋白(bsa)37℃，封闭2h。将待检血清用血清稀释液
按1:2000稀释并加入反应孔中，100μl/孔，每个样品设3个复孔，37℃孵育1h。hrp标记的山羊抗兔igg抗体用血清稀释液按1:5000稀释后加入反应孔中，100μl/孔，37℃孵育1h。tmb显色，每孔50μl，显色10min后，加入50μl终止液终止反应，读取od450nm值。
46.csfv-e0截短蛋白间接elisa结果如图4所示，免疫后7天，即可检测到针对e0蛋白的血清抗体，二免7天后抗体水平显著升高，在免疫后第28天抗体保持较高水平，与灭活csfv抗原相比，抗体水平略高。结果证明，cho细胞表达的e0截短蛋白具有良好的免疫原性。
47.氨基酸突变的csfv-e0截短蛋白间接elisa结果如图5所示，免疫后7天，即可检测到针对e0蛋白的血清抗体，二免7天后抗体水平显著升高，在免疫后第28天抗体保持较高水平。与灭活csfv抗原相比，抗体水平提高，与csfv-e0截短蛋白相当。结果证明，cho细胞表达的氨基酸突变的e0截短蛋白也具有良好的免疫原性。