一种促进莱氏绿僵菌Mr006产孢的培养基及其制剂和应用

一种促进莱氏绿僵菌mr006产孢的培养基及其制剂和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种促进莱氏绿僵菌mr006产孢的培养基及其制剂和应用，确切地说是一种促进莱氏绿僵菌产孢的培养方法，应用于草地贪夜蛾等鳞翅目害虫的防控。


背景技术：

2.现阶段，害虫对作物的危害是造成农业减产的重大因素之一。化学农药的长期大量使用在杀灭害虫的同时也带来了农产品药残超标，害虫抗性水平逐年上升，污染环境等一系列的副作用。鉴于此，生物防治被人们日益重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是害虫生物防治的重要手段之一。与其他杀虫微生物相比，杀虫真菌具有易流行，对环境友好，不易产生抗药性等优点，在害虫的生物防治中占有重要地位。
3.莱氏绿僵菌(metarhizium rileyi)是一种在我国分布广泛的昆虫病原真菌，可侵染多种鳞翅目害虫，尤其对草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、大豆夜蛾、斜纹夜蛾等夜蛾科害虫的侵染力极高，具有较高的开发利用价值。
4.产孢量、产孢时间等是影响莱氏绿僵菌菌株应用的重要因素。目前莱氏绿僵菌发酵基质中，多采用廉价的麦麸、玉米粉、大米粉等农副产品为营养物质，以获得最大孢子产量。优化基质组合过程中，几乎没有把缩短产孢时间作为指标来考量，仅仅以孢子产量为目标。
5.实验室中培养莱氏绿僵菌最常用的培养基为萨斯麦芽糖-酵母培养基和马铃薯培养基，但仍存在产孢率低、孢子萌发率低、产孢周期长和成本高等问题。目前关于无机盐金属离子、虫体组织对莱氏绿僵菌产孢量、产孢时间的研究报道较少。
6.莱氏绿僵菌mr006由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所生物防治团队从太和玉米种植区调查发现田间感染虫生真菌的草地贪夜蛾僵虫中分离鉴定获得。具体测序结果如下(540bp)：
[0007][0008][0009]
试验发现本实验室分离获得的对草地贪夜蛾、玉米螟等都有较好的效果。基于此，
通过添加无机盐金属离子、虫体组织等，进行了莱氏绿僵菌mr006不同组分培养基固体发酵产孢试验，以求简化生产工艺，缩短产孢时间，同时提高孢子产量，降低生产成本，获得一种促进莱氏绿僵菌mr006产孢的培养方法。


技术实现要素：

[0010]
1、要解决的问题
[0011]
针对上述现有技术存在的问题，目的在于提供一种促进莱氏绿僵菌mr006产孢的培养方法，以便为后期发酵生产提供支持。
[0012]
上述目的通过以下方案实现：
[0013]
一种促进莱氏绿僵菌mr006产孢的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0014]
(1)按重量份称取下述组分混匀：大米40、稻壳15、麦芽糖3、黄粉12、酵母粉5、水25、草地贪夜蛾虫体冻干粉1.5、磷酸锌0.15、硫酸亚铁0.1、水23.5；
[0015]
(2)将混匀后原料静置浸泡4小时后，装袋121℃高压灭菌50分钟，待温度降到30℃后接入莱氏绿僵菌mr006液体种子菌液，接种量10％，搅拌混匀后，先
[0016]
28℃光照培养箱培养(16l/8d，光暗交替)，培养3d后；调整温度为24℃，光照(23l/1d，光暗交替)，继续培养，培养14d后，停止发酵，期间定时取样检查。
[0017]
2、技术方案
[0018]
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
[0019]
一种促进莱氏绿僵菌mr006产孢的培养基，所述培养基包括以下组分，以质量份数计，
[0020][0021]
所述虫体冻干粉为草地贪夜蛾虫体冻干粉。
[0022]
所述培养基，所述培养基包括以下组分，以质量份数计，
[0023][0024]
所述虫体冻干粉为草地贪夜蛾虫体冻干粉。
[0025]
所述培养基，所述培养基包括以下组分，以质量份数计，
[0026][0027]
所述虫体冻干粉为草地贪夜蛾虫体冻干粉。
[0028]
任一项所述培养基，所述莱氏绿僵菌metarhizium rileyi mr006的保藏号为cgmcc no.40171，2022年5月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0029]
一种莱氏绿僵菌mr006制剂，由任一项培养基培养并辅以助剂制得，所述制剂的剂型是混悬液。
[0030]
一种如任一项所述培养基在促进产孢上的应用。
[0031]
一种如所述莱氏绿僵菌mr006制剂在促进产孢上的应用。
[0032]
3、有益效果
[0033]
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0034]
莱氏绿僵菌是一种对夜蛾科幼虫有很强致病力的昆虫病原真菌，在自然界常常引发高强度的昆虫流行病。大部分真菌的研究工作都需要对真菌进行室内人工培养，且不同真菌对培养基的养分组成要求差异较大。培养莱氏绿僵菌一般采用萨氏麦芽糖酵母琼脂培
养基(sabo uraud maltose agar supplementedyeast extract，smay)，该种培养基在真菌的菌丝生长、产孢量、产孢速度等方面较为均衡，但生长周期较长，产孢量较低。不同的菌株亦可能对培养组分有不同的反应，因此，针对不同的菌株，其最优培养基的组成成分有所不同。鉴于此，为了更好地开展对莱氏绿僵菌的相关研究，针对一株来源于玉米田间草地贪夜蛾僵虫中分离的菌株mr006进行了培养基的组分筛选、培养条件优化设计，以寻找出一种更好促进莱氏绿僵菌mr006产孢的培养方法，为莱氏绿僵菌mr006应用提供支持。
[0035]
为了获得更好促进莱氏绿僵菌mr006产孢的培养方法，本文在优化实验室培养基及培养条件的的基础上，尝试筛选中试发酵组分，放大培养，分析对产孢开始时间、产孢量的影响。
[0036]
本发明提供促进莱氏绿僵菌mr006产孢的培养方法：
[0037]
(1)按重量(kg)比例称取下述原料混匀：大米40、稻壳15、麦芽糖3、黄粉12、酵母粉5、水25、草地贪夜蛾虫体冻干粉1.5、磷酸锌0.15、硫酸亚铁0.1、水23.5；
[0038]
(2)将混匀后原料静置浸泡4小时后，装袋121℃高压灭菌50分钟，待温度降到30℃后接入莱氏绿僵菌mr006液体种子菌液，接种量10％，搅拌混匀后，先
[0039]
28℃光照培养箱培养(16l/8d，光暗交替)，培养3d后；调整温度为24℃，光照(23l/1d，光暗交替)，继续培养，培养14d后，停止发酵，期间定时取样检查。
[0040]
(3)用吐温-80溶液将固体发酵培养基上收集的分生孢子洗下，得到分生孢子液，按10倍稀释法制成合适浓度稀释液，采用细胞计数法在显微镜下观察并计算孢子量。
具体实施方式
[0041]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0042]
一、材料与方法
[0043]
材料
[0044]
莱氏绿僵菌mr006，由本试验室分离自草地贪夜蛾僵虫，并保存。
[0045]
萨斯麦芽糖-酵母培养基：麦芽糖4％，蛋白胨1％，酵母浸出粉1％，琼脂1.5％。
[0046]
草地贪夜蛾虫体冻干粉：由实验室饲养的6龄幼虫经超低温冷冻干燥，加入液氮碾磨粉碎后获得。
[0047]
液体种子培养基：麦芽糖4％，蛋白胨1％，酵母浸出粉1％，硫酸锌0.15％，硫酸亚铁0.1％。
[0048]
固体发酵培养基用原料及无机盐：大米、稻壳、麦芽糖、黄豆粉、酵母粉、水、硫酸锌、硫酸亚铁等。
[0049]
主要设备：蒸气消毒器、超净工作台、控温摇床、控温生化培养箱、天平、显微镜、孢子收集器等。
[0050]
方法
[0051]
产孢开始时间：菌丝生长过程中，开始出现绿色粉状物时，立即挑出后在显微镜下检查，确定为分生孢子后，即确定为产孢开始时间。
[0052]
孢子计数：将发酵完成后收集的孢子粉从培养基(料)上刮下或用孢子收集器收集后，放入到100ml的锥形瓶中，加入含有0.05％吐温-80的无菌水，在磁力搅拌器上搅30min，使孢子充分分散，配成均匀孢子悬浮液，用血球板计数法确定孢子量。
[0053]
lc
50
值测定：将收集的孢子粉用0.05％吐温-80的无菌水分别配置成1
×
104个/ml、1
×
105个/ml、1
×
106个/ml、1
×
107个/ml、1
×
108个/ml五个浓度孢子悬浮液。每个浓度处理3龄草地贪夜蛾幼虫20头，以0.05％吐温-80水处理作为对照。接种不同浓度菌液后置于人工气候养虫室中饲养，观察、记录10d死亡虫数。重复3次。计算lc
50
值。
[0054]
莱氏绿僵菌mr006孢子侵染率结果：利用最优组合和普通组合分别培养后，获得莱氏绿僵菌mr006孢子粉，分别设置浓度1
×
104个/ml、1
×
105个/ml、1
×
106个/ml、1
×
107个/ml、1
×
108个/ml五个浓度孢子悬浮液，共10个处理，每处理20头虫，4次重复。选用生长一致的草地贪夜蛾3龄幼虫，采用浸虫法上述孢子悬浮液处理，24小时候检测幼虫带菌率。
[0055]
莱氏绿僵菌mr006盆栽试验结果：利用最优组合和普通组合分别培养后，获得莱氏绿僵菌mr006孢子粉，，按照质量百分比
[0056][0057]
制备方法：根据配方，将有效成分增稠剂等固型助剂在油相载体中通过砂磨机研磨，粒径达到2～3微米，按配方加入剩余助剂物质，然后加入莱氏绿僵菌mr006孢子粉，调节至要求浓度，充分剪切、搅拌均匀，得成品。
[0058]
经室内盆栽获得的200株玉米苗，接入草地贪夜蛾3龄幼虫，每株2头。按照亩用制剂量100克茎叶喷施10亿孢子/毫升莱氏绿僵菌mr006可分散油悬浮剂，分别于5、7、14、21天调查防治效果。
[0059]
二、结果与分析
[0060]
促进莱氏绿僵菌mr006产孢产孢培养条件的优化
[0061]
在前期试验基础上，采取萨斯麦芽糖-酵母培养基(smay)，分别设置(1)28℃光照培养箱培养(16l/8d，光暗交替)，培养14d；(2)28℃光照培养箱培养(16l/8d，光暗交替)，培养3d后；调整温度为24℃，光照(23l/1d，光暗交替)，继续培养，培养14d后；比较产孢量。
[0062]
莱氏绿僵菌mr006在培养条件(2)下，生长良好，产孢开始时间早，培养14d后，产孢量达到8.2x108个/cm2，而培养条件(1)的产孢量为1
×
108个/cm2；。由此可见后期降低温度，黑暗条件有利于产孢，培养条件(2)下明显优于培养条件(1)，后续试验确定以培养条件(2)开展。
[0063]
促进莱氏绿僵菌mr006产孢培养组分的优化
[0064]
在前期试验基础上，分别在萨斯麦芽糖-酵母培养基(smay)中加入适量无机盐、虫
体冻干粉(具体见表1)，无添加的萨斯麦芽糖-酵母培养基(smay)为对照，按上述培养条件(2)，即28℃光照培养箱培养(16l/8d，光暗交替)，培养3d后；调整温度为24℃，光照(23l/1d，光暗交替)，继续培养，培养14d；期间确定产孢开始时间，并比较最终产孢量。
[0065]
表1培养基组分优化试验结果
[0066][0067][0068]
从表1结果可知，在萨斯麦芽糖-酵母培养基(smay)中加入不同种类无机盐、虫体冻干粉对莱氏绿僵菌mr006产孢开始时间、产孢量及lc
50
值均有影响。氯化钙抑制了生长，产孢开始时间滞后，产孢量下降明显，lc
50
值显著上升；磷酸氢二钾对产孢量略有影响；硫酸锰可适当提前产孢开始时间，对lc
50
值影响不大；硫酸锌将产孢开始时间由8天提前至4天，随着添加量增加同时产孢量也随之提高，最高可达8.6
×
108个/cm2，lc
50
值略有下降；硫酸亚铁将产孢开始时间由8天提前至5天，同时产孢量也显著提高，最高可达8.8
×
108个/cm2，lc
50
值略有下降，；而虫体冻干粉的加入亦可缩短产孢开始时间，提高产孢量，最高可达9.3
×
108个/cm2，可显著降低lc
50
值。
[0069]
由此可知硫酸锌、硫酸亚铁、草地贪夜蛾虫体冻干粉，可以显著缩短产孢开始时间，提高产孢量，提高mr006菌株毒力。。
[0070]
莱氏绿僵菌mr006固体发酵工艺
[0071]
按照表2组分配比，进行含草地贪夜蛾虫体冻干粉培养基的优化，以产孢开始时间、产孢量为指标，确定适合莱氏绿僵菌mr006的最佳固体发酵工艺。
[0072]
将保存的莱氏绿僵菌mr006接入液体种子培养基中，培养3-5天，待培养液混浊，出现菌丝球时停止培养待用。将按表2处理将原料混匀后，静置浸泡4小时后，装袋121℃高压灭菌50分钟，待温度降到30℃后接入莱氏绿僵菌mr006液体种子菌液，接种量10％，搅拌混匀后，先28℃发酵培养72小时后，温度降低至24℃，继续培养，确定产孢开始时间，直至产孢完全，停止发酵，期间定时取样检查。发酵结束后，利用孢子收集器收取孢子粉，计算产孢量。
[0073]
表2莱氏绿僵菌mr006固体发酵试验结果
[0074][0075][0076]
从表2试验结果可知：不同组分配比的固体发酵培养基对莱氏绿僵菌mr006的产孢开始时间缩短、产孢量影响差异较大，15个处理孢子量最高为11.2
×
109个/g、最低为1.6
×
109个/g；产孢开始时间最早为4d、最迟为9d。lc
50
值最低为3.3
×
106个/ml，最高为8.94
×
106个/ml。其中以处理5组合最优，产孢时间由9天缩短至4天，产孢量可提高至11.2
×
109个/g。lc
50
值为3.3
×
106个/ml，其次为处理11组合，产孢时间由9天缩短至5天，产孢量可提高至10.2
×
109个/g。lc
50
值为3.5
×
106个/ml。
[0077]
由此可知，通过添加硫酸锌、硫酸亚铁、草地贪夜蛾虫体冻干粉等优化组分配比后，莱氏绿僵菌mr006产孢开始时间缩短、产孢量获得提高、对草地贪夜蛾毒力提升。
[0078]
莱氏绿僵菌mr006孢子侵染率结果
[0079]
从表3结果可知：随着莱氏绿僵菌mr006孢子浓度的升高，侵染率也相应升高。当莱氏绿僵菌mr006孢子浓度高于1
×
105孢子/毫升时，经最优组合培养(添加硫酸锌、硫酸亚铁、草地贪夜蛾虫体冻干粉)获得的孢子侵染率要高于普通组合(无上述添加物)。由此可知，添加添加硫酸锌、硫酸亚铁和草地贪夜蛾虫体冻干粉，有利于提升莱氏绿僵菌mr006孢子对草地贪夜蛾幼虫的侵染率。
[0080]
表3莱氏绿僵菌mr006对草地贪夜蛾幼虫侵染率与孢子浓度水平的关系
[0081][0082]
莱氏绿僵菌mr006孢子盆栽试验结果
[0083]
从表4结果可知：10亿孢子/毫升莱氏绿僵菌mr006可分散油悬浮剂在盆栽试验中对草地贪夜蛾具有较好的防治效果。在药后同一时间，经最优组合培养(添加硫酸锌、硫酸亚铁、草地贪夜蛾虫体冻干粉)获得的孢子加工的10亿孢子/毫升莱氏绿僵菌mr006可分散油悬浮剂防治效果要高于普通组合(无上述添加物)。由此可知，添加硫酸锌、硫酸亚铁、草地贪夜蛾虫体冻干粉，有利于提升莱氏绿僵菌mr006孢子对草地贪夜蛾幼虫的防治效果。
[0084]
表4莱氏绿僵菌mr006孢子在草地贪夜蛾防治中的应用效果
[0085][0086]
结论：大米40、稻壳15、麦芽糖3、黄粉12、酵母粉5、水25、草地贪夜蛾虫体冻干粉1.5、磷酸锌0.15、硫酸亚铁0.1、水23.5；是莱氏绿僵菌mr006固体发酵基质较优组合；将混匀后原料静置浸泡4小时后，装袋121℃高压灭菌50分钟，待温度降到30℃后接入莱氏绿僵菌mr006液体种子菌液，接种量10％，搅拌混匀后，先28℃光照培养箱培养(16l/8d，光暗交替)，培养3d后；调整温度为24℃，光照(23l/1d，光暗交替)，继续培养，培养14d后，停止发
酵。
[0087]
添加硫酸锌、硫酸亚铁、草地贪夜蛾虫体冻干粉等优化组分配比后，莱氏绿僵菌mr006产孢开始时间缩短、产孢量获得提高，对草地贪夜蛾毒力提升。目前文献报道中，尚未见到相关报道。