靶向人血清白蛋白的单域抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向人血清白蛋白的单域抗体及其应用。

背景技术：

1、人血清白蛋白(hsa)是一种血液中含量最丰富且化学性质较为稳定的蛋白质，其是由585个氨基酸组成的单链非糖基化多肽，分子质量为66.5kd，等电点在4.7-4.9之间。成熟的hsa是一个心形分子结构，由3个结构相似的α-螺旋结构域组成(ⅰ、ⅱ和ⅲ)，每个结构域包含2个亚结构域(a和b)，其中结构域ⅱa和ⅲa能够与内源和外源物质相结合。氨基酸全序列含有18种氨基酸，n末端为天冬氨酸，c末端为亮氨酸。其中含半胱氨酸35个，在单链分子内形成17对交叉相连的二硫键从而加固了分子的稳定性，提高了对酸和热的耐受性较高，同时分子内大量极性氨基酸也使hsa有较高的溶解度。

2、hsa是血液系统的重要组分，仅由肝实质细胞合成，占血浆总蛋白的40-60％，分泌进入血液循环系统并发挥着非常重要的生理功能，包括维持血浆胶体渗透压，结合并运输药物和小分子物质以及消除自由基抗氧化等。此外，hsa是血浆中分子量最小的蛋白质，具有亲水性，可以自由通过毛细血管壁，在血液循环与细胞外液之间进行动态交换，维持血液和细胞外液的胶体渗透压的平衡。

3、人血清白蛋白(has)由于其半衰期长、稳定性好、无免疫原性等特点，已被用于融合蛋白的构建以实现蛋白药物的长效性。结合人血清白蛋白的单域抗体及其融合蛋白则是利用其游离型和结合型在血浆内形成平衡的特点，实现缓释和长效的作用。其在增加治疗相关蛋白和多肽的半衰期的应用已通过很多研究及临床试验得到证实(如wo04/041862，wo2006/122786，wo2008/020079，wo2008/142164，wo2009/068627和wo2009/147248等)。尽管已有埃博灵克斯公司开发的has单域抗体应用于长效性蛋白药物开发，但对此类抗体的差异性开发，包括针对不同结合表位或是不同亲和力的抗体的获得，都会给以此为基础的长效性平台系统开发提供更多的选择。此外，由于开发方案的不同，可能通过不同的免疫动物和优化的筛选方法得到性质更为改善的单域抗体，以更好地实现预期的功能。例如，专利cn201811314177.3和专利cn201811314193.2分别公开了不同的抗人血清白蛋白单域抗体，具有良好特异性、较高亲和力和稳定性，能特异性的识别人血清白蛋白，延长生物药物的半衰期。

4、尽管现有技术中已有针对人血清白蛋白的结合蛋白或单域抗体，但其种类较少，因此，亟需开发种属交叉特性、稳定性更好，聚体更少的人血清白蛋白单域抗体。

技术实现思路

1、针对上述不足，本发明提供了一种靶向人血清白蛋白的单域抗体及其应用。本发明采用人血清白蛋白免疫骆驼，筛选得到了一系列抗人血清白蛋白的单域抗体，所述的单域抗体亲和力高，且种属交叉特性好，热稳定性及贮存稳定性更好，聚体较少，可有效延长生物药物的半衰期，有利于生物药在治疗中的有益效果。

2、为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一方面，本发明提供了一种靶向人血清白蛋白的单域抗体，所述的单域抗体包含以下互补决定区：

4、(1)包含seq id no:1-seq id no:2中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的互补决定区1cdr1；

5、(2)包含seq id no:3-seq id no:4中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的互补决定区2cdr2；

6、(3)包含seq id no:5-seq id no:6中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的互补决定区3cdr3；

7、优选地，所述变体序列为与其来源的cdr相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的cdr序列；所述的置换为保守置换。

8、具体地，所述的单域抗体包含：

9、(1)如seq id no:1所示的cdr1，如seq id no:3所示的cdr2，如seq id no:5所示的cdr3；和/或

10、(2)如seq id no:2所示的cdr1，如seq id no:4所示的cdr2，如seq id no:6所示的cdr3。

11、进一步具体地，所述的单域抗体包含：

12、(1)如seq id no:7所示的氨基酸序列；和/或

13、(2)如seq id no:8所示的氨基酸序列；和/或

14、(3)如seq id no:9所示的氨基酸序列；和/或

15、(4)如seq id no:10所示的氨基酸序列。

16、另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白为使用任一所述的单域抗体与一个或一个以上具有治疗功能的多肽分子融合在一起制备所得。

17、具体地，所述融合蛋白由所述单域抗体与所述具有治疗功能的多肽分子直接融合；或所述单域抗体通过接头肽连接含1个或者1个以上所述具有治疗功能的多肽分子制备的融合蛋白。

18、又一方面，提供了一种多特异性分子，所述的多特异性分子包含任一所述的单域抗体。

19、又一方面，本发明提供了一种偶联物，所述的偶联物包括所述单域抗体部分和偶联部分。

20、具体地，所述单域抗体部分和偶联部分通过连接片段进行偶联。

21、又一方面，本发明提供了一系列编码所述单域抗体的核酸分子。

22、具体地，所述的核酸分子包含一种或多种经密码子优化的核酸分子。

23、进一步具体的，所述的核酸分子为：

24、(1)如seq id no:12所示的核苷酸序列；和/或

25、(2)如seq id no:13所示的核苷酸序列；和/或

26、(3)如seq id no:14所示的核苷酸序列；和/或

27、(4)如seq id no:15所示的核苷酸序列。

28、又一方面，本发明提供了一系列载体，所述的载体包含本技术所述的一个或多个核酸分子。

29、具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。

30、又一方面，本发明提供了一种蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽是由上述载体通过表达系统进行表达得到；所述表达系统为细菌、酵母菌、丝状真菌、真核哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或无细胞表达系统。

31、又一方面，本发明提供了一系列包含上述核酸分子或上述载体的宿主细胞。

32、具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞，可通过本领域技术人员已知的方法将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等方法。

33、具体地，所述的宿主细胞能够表达上述单域抗体、核酸分子、融合蛋白、多特异分子、载体或蛋白质或多肽。

34、又一方面，本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含上述单域抗体、融合蛋白、多特异性分子、核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白质或多肽和/或偶联物。

35、具体地，所述的药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体。

36、进一步具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。

37、具体地，所述的药物组合物还包含组合治疗剂，所述的组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物。

38、又一方面，本发明提供了所述的单域抗体、融合蛋白、多特异性分子、核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白质或多肽和/或偶联物在制备药物组合物中的应用。

39、与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

40、本发明采用人血清白蛋白免疫骆驼，筛选得到了一系列抗人血清白蛋白的单域抗体，所述的单域抗体亲和力高，且种属交叉特性好，热稳定性及贮存稳定性更好，聚体较少，可有效延长生物药的半衰期，有利于生物药在治疗中的有益效果。