一株戊糖片球菌及其应用的制作方法

1.本发明主要涉及微生物技术领域，具体涉及一株戊糖片球菌及其应用。


背景技术：

2.皮肤作为人体最大的器官生活着广泛的微生物，皮肤构成了陷入部、经特化的间隙等多样形态的栖息地，帮助分布广泛的微生物能够生存。微生物与作为宿主的人构成了共生关系，皮肤微生物群在宿主中发挥重要而有用的功能，不仅因为它有能力抵抗皮肤病原体的粘附和发展，还因为它有能力与免疫系统对话和相互作用。微生物和皮肤环境之间的平衡一旦被打破，本来无害的微生物将由健康状态变为致病状态，就会引起各种皮肤疾病；反之，皮肤疾病也会导致皮肤微生物结构异常和菌群失调，所以很多皮肤问题都与皮肤微生态失衡有着密切关系。
3.益生菌在维持宿主机体稳态，激活免疫系统、维持机体免疫平衡等方面具有重要作用，研究发现益生菌能通过调节巨噬细胞的吞噬能力以及细胞因子的释放来控制全身免疫状态，从而预防和治疗各种炎症疾病。
4.皮肤作为抵御外界不良因素侵扰的第一道防线，皮肤屏障是由角质层的表皮形成细胞和角质间的脂质形成的结构性的屏障。皮肤屏障防止人体过多水分释放，并防止如化学物质或微生物的有害物质进入我们的身体。组成死亡的角质细胞的表面的角质细胞外皮在细胞间脂质的稳定性中起重要作用。皮肤屏障受损将引起皮肤干燥,皮肤老化、色素沉着异位性皮炎、湿疹、银屑病、鱼鳞病、日旋旋旋旋旋光性皮炎等皮肤敏感、刺激性皮炎、激素依赖性皮炎等皮肤油腻,皮脂溢出性疾病,如痤疮、酒糟鼻、脂溢性皮炎。
5.痤疮是一种常见的慢性炎症性皮肤疾病，主要与皮脂分泌过多、毛囊皮脂腺导管堵塞、细菌感染和炎症反应等因素密切相关。研究表明，痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acne)被认为引发痤疮的主要病原菌，它可以诱导和活化痤疮炎症的起始环节，并将甘油转换为脂肪酸，导致炎症反应；同时产生蛋白酶、透明质酸酶及趋化因子，使毛囊过度角化，形成痤疮。另一方面，皮肤常驻的表皮葡萄球菌与痤疮丙酸杆菌能够相互拮抗竞争，增加表皮葡萄球菌的数量能够抑制痤疮丙酸杆菌增殖。因此，降低痤疮丙酸杆菌/表皮葡萄球菌的菌群比例，可以有效缓解痤疮炎症，从而通过调节皮肤微生态平衡来维持皮肤健康。
6.益生菌用在化妆品上，可平衡皮肤表皮菌群，修复皮肤屏障。正如文献中报道的，益生菌外用可以治疗特异性皮炎，促进皮肤屏障的修复。同时研究发现益生菌能通过调节巨噬细胞的免疫功能以及吞噬能力来预防和治疗各种炎症疾病，并能有效增加肌肤对营养物质的吸收，抗自由基，增强肌肤的免疫力。
7.利用微生态技术开发的益生菌相关产品，能够有效解决上述问题。


技术实现要素：

8.为实现上述技术目的，本发明从发酵苏子叶中分离鉴定得到一株戊糖片球菌，将其编号gforu-10，该菌株及其相关代谢产物可以促进修护皮肤屏障，且兼具抗炎、抑菌、保
湿等作用，在食品、药品、化妆品等领域具有极大的市场潜力。
9.本发明首要技术方案是提供了一株戊糖片球菌(pediococcus pentosaceus)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20211556。
10.该戊糖片球菌来源于发酵苏子叶，编号为gforu-10，经16s rrna鉴定为戊糖片球菌(pediococcus pentosaceus)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。
11.经大量研究试验，上述戊糖片球菌具有非常显着的抑菌、消炎作用，并且可以调节皮肤屏障修复、皮肤保湿等相关基因的表达。因此，本发明进一步提供了该菌株的用途，其可以用于促进皮肤屏障修复、抗炎、抑菌、皮肤保湿。因此，该菌株的另一用途，可以用于制备具有促进皮肤屏障修复、抗炎、抑菌、皮肤保湿作用相关的食品、药品、化妆品等。
12.所述的抑菌主要是抑制痤疮丙酸杆菌或/和金黄色葡萄球菌或/和人葡萄球菌或/和溶血葡萄球菌或/和干燥棒杆菌或/和白色念珠菌或/和变异链球菌的生长
13.进一步的，在用于制备相关食品、药品、化妆品等产时，所述的戊糖片球菌可以是其菌体或/和其衍生物或/和其代谢产物。
14.其中，所述的菌体可以是活菌或/和灭活菌体；
15.所述的衍生物为戊糖片球菌的裂解物或/和提取物，包括但不限于细胞壁、胞内蛋白、胞内多糖等；
16.所述的代谢产物应当理解为戊糖片球菌的初级代谢产物或次级代谢产物，例如益生素、含有免疫原性成分的化合物，胞外多糖等，也可以直接是发酵液的上清液。
17.本发明的戊糖片球菌gforu-10具有以下有益效果：
18.体外抑菌试验表明,本发明的戊糖片球菌gforu-10对金黄色葡萄球菌、变异链球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、干燥棒杆菌、痤疮丙酸杆菌、白色念珠菌等病原菌均具有较强的抑制作用，抑菌率14.2％-54.2％。
19.体外细胞实验表明，本发明的戊糖片球菌gforu-10具有降低炎症因子释放的作用，能够降低脂多糖(lps)诱导小鼠巨噬细胞raw264.7的一氧化氮(no)生成量31.10％～53.60％。
20.体外细胞实验表明，本发明的戊糖片球菌gforu-10具有下调金黄色葡萄球菌诱导的hacat细胞炎症因子il-6、il-8、il-22、环氧合酶-2基因cox-2、辣椒素受体1基因trpv1表达的作用，基因表达量下调24％～82％。
21.体外细胞实验表明，本发明的戊糖片球菌gforu-10具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因flg、外皮蛋白基因ivl、ovo样转录因子1基因ovol1、兜甲蛋白基因lor表达的作用，基因表达量上调1.34～2.02倍。
22.体外细胞实验表明，本发明的戊糖片球菌gforu-10具有上调保湿因子水通道蛋白3基因aqp3、保湿因子β-葡糖脑苷脂酶基因gba表达的作用，上调表达1.09-2.14倍。
23.保藏信息
24.保藏时间：2021年12月6日；
25.保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
26.保藏编号：cctcc no:m 20211556；
27.保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；
28.分类命名：戊糖片球菌(pediococcus pentosaceus)。
具体实施方式
29.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。
30.以下实施例中gforu-10均指戊糖片球菌(pediococcus pentosaceus)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20211556。
31.实施例一：gforu-10的分离
32.于发酵苏子叶中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于mrs固体平板，37℃恒温培养24～48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为gforu-10。
33.革兰氏染色镜检：菌株gforu-10为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
34.实施例二：gforu-10的核酸鉴定
35.1、16s rrna基因序列分析：
36.挑取单菌落置mrs液体培养基中，37℃培养过夜后，离心收集菌体，按照dna提取试剂盒步骤进行操作。引物用细菌通用引物27f,1492r，pcr扩增体系为50μl体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。
37.2、结果
38.pcr产物测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较(blastn)后得出gforu-10菌株为戊糖片球菌(pediococcus pentosaceus)。
39.实施例三：gforu-10抑制金黄色葡萄球菌等致病菌抑菌实验-菌液浓度变化
40.1、戊糖片球菌gforu-10菌液制备：
41.将活化的戊糖片球菌gforu-10菌液以mrs液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16-18h，检测并以mrs液体培养基调整od
600
＝2.0，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，121℃，30min灭活得待测样品。
42.2、病原菌菌液制备：
43.将7种病原菌：金黄色葡萄球菌金黄亚种cgmcc 1.8721、人葡萄球菌cgmcc 1.493、溶血葡萄球菌cgmcc 1.540、干燥棒杆菌cgmcc 1.1919、痤疮丙酸杆菌cgmcc1.5003、变异链球菌cgmcc 1.2499、白色念珠菌cgmcc2.4550以bhi培养基37℃培养18h，检测od600测定菌数，用bhi培养基调整病原菌菌液浓度为1x10
8 cfu/ml。
44.3、抑制病原菌实验
45.按照10％(v/v)加入量将灭活上清液加入各病原菌菌液中(对照组加入相同量的mrs培养基)，37℃培养2h，以菌液浓度(od
600
)降低百分比评价对病原菌生长影响。
46.4、结果
[0047][0048][0049]
结果显示gforu-10对金黄色葡萄球菌、变异链球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、干燥棒状杆菌、痤疮丙酸杆菌、白色念珠菌等病原菌均具有较强的抑制作用，抑菌率14.2％-54.2％，抑菌效果显着。
[0050]
实施例四：gforu-10降低raw264.7细胞no生成量
[0051]
1、gforu-10菌液制备
[0052]
将gforu-10用mrs培养基培养过夜，检测od
600
，并用pbs缓冲液调整菌液浓度至od
600
＝0.2，离心后，上清液用0.22μm滤膜过滤,菌体经pbs清洗两次后以pbs重悬至od
600
＝0.2,上清液和菌体样品最后以121℃高压灭菌30min灭活。
[0053]
2、raw264.7细胞制备
[0054]
将raw264.7细胞消化后以2
×
105cell/孔接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
[0055]
3、gforu-10添加及lps刺激
[0056]
培养过夜的raw264.7细胞，实验组1加入上清液5％(v/v，相应对照组加等体积pbs)、实验组2加入灭活菌体10％(v/v，相应对照组加等体积pbs)，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导raw264.7细胞发炎，20h后取细胞培养上清，按照碧云天no检测试剂盒所述方法进行标准曲线绘制，计算样品中no的浓度及抑制率。
[0057]
结果：
[0058]
gforu-10降低raw264.7细胞no生成量
[0059][0060]
结果显示gforu-10能够降低lps诱导的raw264.7细胞no生成量，与lps对照组相比上清液降低53.60％，灭活菌体降低31.10％，说明该菌株及其发酵液均具有抗炎作用。
[0061]
实施例五：gforu-10下调hacat细胞炎性因子的表达
[0062]
1、gforu-10样品制备
[0063]
将gforu-10用mrs培养过夜，检测od
600
，并用pbs缓冲液调整菌液浓度至od
600
＝0.2，离心后去除菌体，上清液用0.22μm滤膜过滤,最后以121℃高压灭菌30min灭活。
[0064]
2、hacat细胞制备
[0065]
将hacat细胞消化后以2
×
105cell/孔接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
[0066]
3、金黄色葡萄球菌制备及添加
[0067]
金黄色葡萄球菌接入营养肉汤培养基，37℃摇床培养过夜，用mem无血清培养基调整菌液浓度至od
600
＝6，每孔100μl添加入培养过夜的hacat细胞中，刺激细胞产生炎症因子，3h后弃去细胞培养基，pbs清洗5次，每孔重新加入1ml的mem无血清培养基。
[0068]
4、gforu-10样品添加
[0069]
将gforu-10上清液以5％加入金黄色葡萄球菌刺激过的hacat细胞中，每组3个复孔，培养过夜。
[0070]
5、qpcr法检测细胞炎症因子mrna相对表达倍数
[0071]
将上述细胞弃去培养基后，用rna提取试剂盒提取rna，检测rna浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，用反转录试剂盒、sybrgreen qpcr试剂盒进行rt-pcr及qpcr，计算炎症因子基因相对表达倍数f。
[0072]
公式：f＝2-δδct
[0073]
结果：
[0074]
gforu-10下调炎症相关因子的表达
[0075][0076]
结果显示gforu-10能够下调金黄色葡萄球菌诱导的hacat炎性因子il-6、il-8、il-22、cox-2、trpv1基因表达量均有降低，表达量下调24％-82％。因此，gforu-10具有抗炎作用。
[0077]
实施例六：gforu-10促进hacat屏障修复相关基因表达实验
[0078]
1、gforu-10样品制备(同实施例四)。
[0079]
2、接种人永生化角质形成细胞hacat(5
×
105cell/孔)至6孔板，过夜培养至细胞贴壁。实验组1加入菌株上清液5％(v/v，相应对照组加等体积pbs)，实验组2加入灭活菌体10％(v/v，相应对照组加等体积pbs)，每组设置3个平行，分别培养24h后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，并反转录为cdna，gapdh作为内参基因，进行qpcr检测flg、ovol1、lor、ivl基因的表达。根据公式进行计算表达变化倍数。
[0080]
公式：f＝2-δδct
[0081]
其中：
[0082]
△
ct
实验
＝ct
实验-ct
内参(实验)
；
[0083]
△
ct
对照
＝ct
对照-ct
内参(对照)
；
[0084]
△△
ct＝
△
ct
实验
‑△
ct
对照
。
[0085]
结果：
[0086]
实验组1(gforu-10上清液)上调修复基因的表达
[0087][0088]
实验组2(gforu-10灭活菌体)上调修复基因的表达
[0089][0090][0091]
结果显示加入gforu-10具有促进皮肤屏障修护的作用。
[0092]
实施例七：gforu-10上调hacat保湿相关基因表达实验
[0093]
1、gforu-10样品制备(同实施例四)。
[0094]
2、接种人永生化角质形成细胞hacat(5
×
105cell/孔)至6孔板，过夜培养至细胞贴壁。实验组1加入菌株上清液5％(v/v，相应对照组加等体积pbs)，实验组2加入灭活菌体10％(v/v，相应对照组加等体积pbs)，每组做3个平行，分别培养24h后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，并反转录为cdna，进行qpcr检测保湿相关基因aqp3、gba的表达。根据公式进行计算表达变化倍数。
[0095]
公式：f＝2-δδct
[0096]
结果：
[0097]
实验组1(gforu-10上清液)上调保湿基因的表达
[0098][0099]
实验组2(gforu-10灭活菌体)上调保湿基因的表达
[0100][0101]
结果显示加入gforu-10发酵上清液或灭活菌体，均对保湿相关基因aqp3、gba的表达具有上调作用，因此该菌体促进皮肤保湿的作用。
[0102]
另外，上述所有实施例中涉及到的发酵上清液或灭活菌体，经验证，对其进行进一步加工、提取等获得的戊糖片球菌的衍生物(裂解物或提取物)，或发酵上清液中的戊糖片球菌的初级代谢产物或次级代谢产物等均具有相应的功效。