一株沙福芽孢杆菌SC-11及其应用

11，产物通过超高效液相色谱筛选，质谱定性，确定为绿原酸，其分泌绿原酸的能力可达45.73mg/l，在农业、养殖业都具有良好的应用前景。
14.保藏信息说明
15.沙福芽孢杆菌(bacillus safensis)sc-11于2022年05月03日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏号为cctcc m 2022543。
附图说明
16.图1为绿原酸与沙福芽孢杆菌(bacillus safensis)sc-11产物的液相色谱图。
17.图2为绿原酸与沙福芽孢杆菌(bacillus safensis)sc-11产物的二级特征谱图。
18.图3为沙福芽孢杆菌(bacillus safensis)sc-11在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落形态。
19.图4为本发明沙福芽孢杆菌(bacillus safensis)sc-11的显微镜观察。
20.图5为本发明沙福芽孢杆菌(bacillus safensis)sc-11的扫描电镜图。
21.图6为本发明沙福芽孢杆菌(bacillus safensis)sc-11的电泳图。
具体实施方式
22.下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
23.实施例中采用的培养基组分如下：
24.牛肉膏蛋白胨液体培养基(be)：牛肉浸粉5g，蛋白胨10g，nacl 5g，去离子水1l，ph调节至7.2-7.4；
25.牛肉膏蛋白胨固体培养基(ba)：牛肉浸粉5g，蛋白胨10g，nacl 5g，琼脂20g，去离子水1l，ph调节至7.2-7.4。
26.实施例1
27.沙福芽孢杆菌sc-11的分离与合成绿原酸的鉴定
28.1、沙福芽孢杆菌sc-11的分离
29.1.1、取样：在广西壮族自治区广西药用植物园采集植物样本华南忍冬叶片，置于样品袋中，与4℃冰箱保存；
30.1.2、筛选：采用涂布平板法，取采集的植物叶片，浸泡在75％酒精中60s，用无菌水冲洗干净，浸泡在5％次氯酸钠溶液中表面消毒15s，消毒处理的样品用无菌剪刀剪切成小块置于研钵中，研磨后，吸取100μl，涂布至牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，于37℃恒温培养箱培养2d；挑取生长较好的多株菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基(be)，发酵5d，75％酒精和发酵上清液1:1混合，浸提5h，浓缩至1ml，加2ml甲醇复溶，过0.22μm滤膜，制备样品溶液；在325nm下用超高效液相色谱uplc检测；uplc的参数为：色谱柱：thermo fisher scientific hypersil gold aq 100
×
2.1mm 3μm，流动相a：乙腈，b：0.1％甲酸，条件为：0-2min，5％a，95％b；2-8min，95％a，5％b；8-10min，95％a，5％b；10-15min，5％a，95％b，进样量，1μl；
31.1.3、定性：在uplc中与绿原酸标准品有相同出峰时间的样品，利用thermo fisher q-exactive检测，利用电喷雾电离源(esi)的负离子[mh]-检测模式，绿原酸标准品在m/z353.0867中被检测，去质子化物质在m/z191.0552处碎裂，与绿原酸标品比对，发现一株命名为sc-11的菌株具有产绿原酸的能力(图1-2)；
[0032]
1.4、定量：上述样品溶液利用高效液相色谱hplc定量，hplc的参数为：waters色谱系统，色谱柱(jade-pak ods-aq c18柱；250mm
×
4.6mm，5μm；echway corporation，guangzhou，china)，流动相0.5％乙酸水(a)和乙腈(b)；梯度洗脱，条件为：0min，95％a和5％b；5min，92％a和8％b；15min，50％a和50％b；20min，10％a和90％b；21-25min，95％a和5％b；柱温35℃；流速，1ml/min；进样量，10μl；检测波长327nm。
[0033]
2、菌株sc-11的鉴定
[0034]
2.1、将得到的菌株sc-11进行一系列生理生化鉴定，并提取dna进行16srdna的扩增和测序，所得结果如下：
[0035]
该菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成边缘褶皱的乳白色菌落(图3)；
[0036]
显微镜镜检显示短杆状、革兰氏阳性细菌(图4)；
[0037]
扫描电镜观测菌体成短圆杆状，无鞭毛，菌体大小为(1.8-2.0)μm，(0.8-0.9)μm(图5)；
[0038]
其他检测项目如表1所示：
[0039]
表1菌株sc-11的生理生化特征
[0040][0041][0042]
注：“+”表示阳性反应，存在或有，
“‑”
表示阴性反应，不存在或无。
[0043]
2.2、利用引物27f和1492r进行16srdna扩增，引物序列如下：
[0044]
27f:5
′‑
agagtttgatcatggctcag-3
′
[0045]
1492r：5
′‑
tagggttaccttgttacgactt-3
′
[0046]
pcr扩增条件为95℃2min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，35cycles，72℃2min，4℃保存；
[0047]
对pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳验证(电泳图如图6所示)然后送公司测序，测序结果如seq.id.no.1所示，菌株sc-11的16s rdna的序列长度为1438bp，经同源比对，其与bacillus safensis strain mxr1709b01(genebank accession no mn17650.1)具有99％的高度相似性，结合菌株sc-11的菌株形态学和生理生化特征，鉴定该菌株为bacillus safensis菌属的一个菌株，命名为沙福芽孢杆菌(bacillus safensis)sc-11，将其保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctcc m 2022543。
[0048]
实施例2
[0049]
沙福芽孢杆菌sc-11在合成绿原酸中的应用
[0050]
绿原酸产量的检测方法与实施例1中1.4的方法一致。
[0051]
将沙福芽孢杆菌sc-11置于基础培养基(基础培养基组分为葡萄糖10g/l，酵母浸粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l)中培养至对数期，以体积百分比1％的接种量置于优化发酵培养基(优化发酵培养基组分为果糖55.12g/l、玉米浆25.31g/l、kh2po
4 5.05g/l、feso
4 0.1g/l、mgso
4 0.05g/l和l-酪氨酸2g/l)中，装瓶量30ml，32℃、200rpm、ph为7的条件下培养5天，测定绿原酸产量，菌株分泌绿原酸的能力为45.73mg/l。
[0052]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。