一种荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.线粒体呼吸作用除了为细胞的生存与发展提供能量之外，也会因为呼吸链的电子泄露诱发大量的活性氧(ros)。o2·-是呼吸链电子泄露所产生的第一个ros，产生的o2·-在超氧歧化酶的催化下转化为h2o2，h2o2不仅能在髓过氧化物酶的催化下与细胞内cl-和br-反应生成hclo和hbro，而且能在fe
2+
离子的催化下发生fenton反应产生ho
·
。在细胞氧化还原平衡失衡的条件下，过度产生的ros能够氧化细胞内各种生物大分子，造成细胞正常功能的损伤，最终引发各种各样的疾病。其中，o2·-能引发体内脂质过氧化，加快从皮肤到内部器官整个肌体的衰老过程，并可诱发皮肤病变、心血管疾病、癌症等，严重危害人体健康。实际上，为了维持氧化还原平衡，细胞天然表达了各种各样的抗氧系统(如小分子生物硫醇、大分子抗氧化酶类、维生素c等)，在维持细胞内氧化还原平衡方面扮演了关键的角色。在小分子生物硫醇中，半胱氨酸(cysteine，cys)除了与同型半胱氨酸(hcy)、谷胱甘肽(gsh)共同维持着生物体内氧化-还原平衡外，在蛋白质合成、解毒和新陈代谢方面等方面也扮演着重要的角色。cys浓度的异常也会引发一系列疾病，高浓度的cys与神经系统疾病密切相关，cys缺失可以导致生长缓慢、脑水肿、嗜睡、肝损伤等疾病。鉴于此，开发一种可以同时传感cys和o2·-的荧光探针，不仅对于cys和o2·-的生理病理疾病的相关性研究，而且对于相关治疗药物的开发均意义重大。


技术实现要素：

3.针对上述问题，本发明提供了一种可以同时传感cys和o2·-的荧光探针及其制备和应用。该探针可与cys发生“取代-重排”反应，生成一个绿荧光的“胺基-吡啰红”染料；与gsh发生仅发生“取代”反应，生成一个红色荧光的“硫代吡啰红”染料；hcy和cys在结构上仅仅是一个亚甲基的差异，具有相似的反应性能，但考虑到hcy在细胞内极低的浓度，由hcy所造成的干扰通常可忽略。此外，探针可以与o2·-发生“氧化-水解”反应，生成一个蓝荧光的“吡啰红酮”染料。总的来说，探针可以从绿色和蓝色两个通道实现对cys和o2·-的同时传感。
4.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
5.一种荧光探针，所述探针可以同时传感半胱氨酸和超氧自由基，探针为pycltp，其结构式为：
[0006][0007]
一种所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0008][0009]
(1)将吡啰红b(化合物1)和氰化钾加入水中，回流后，冷却至室温，过滤，洗涤，滤饼溶解在盐酸水溶液中，并逐滴加入到六水氯化铁的盐酸水溶液中，反应液反应后冷却至室温，过滤，洗涤，滤饼溶解在饱和的碳酸氢钠溶液中回流，冷却至室温有固体析出，过滤得粗品，粗产品经柱色谱分离得亮黄色固体吡啰红酮(化合物2)；
[0010]
(2)在氮气保护下，将吡啰红酮(化合物2)溶于溶剂中，搅拌得到吡啰红酮溶液，然后向上述吡啰红酮溶液中逐渐滴加三氟甲基磺酸酐，反应液反应后加入4-氯苯硫酚，混合物在室温下反应过夜，旋干溶剂，粗产品经柱色谱分离得到“对氯苯硫酚功能化”的吡啰红染料，即所述探针。
[0011]
进一步，所述步骤(1)中吡啰红b、氰化钾与六水氯化铁的摩尔比为1：3：3.5。
[0012]
进一步，所述步骤(1)中盐酸水溶液的浓度为2mol/l。
[0013]
进一步，所述步骤(1)中吡啰红b和氰化钾加入水中回流的时间为18h；所述反应液的反应温度为90℃，反应时间为12h；所述在饱和的碳酸氢钠溶液中回流3h。
[0014]
进一步，所述步骤(1)中洗涤用水洗涤，所述柱色谱展开剂ch2cl2/meoh的体积比为50：1。
[0015]
进一步，所述步骤(2)中吡啰红酮、三氟甲基磺酸酐与4-氯苯硫酚的摩尔比为1：4：10。
[0016]
进一步，所述步骤(2)中溶剂为乙腈，搅拌的温度为0℃，时间为10min，反应液反应的时间为30min。
[0017]
进一步，所述步骤(2)中柱色谱分离展开剂ch2cl2：ch3oh的体积比为20：1。
[0018]
一种所述荧光探针的应用，在制备同时检测细胞内半胱氨酸和超氧自由基试剂中的应用。
[0019]
与现有技术相比本发明具有以下优点：
[0020]
本发明提供的探针能与cys发生“取代-重排”反应生成绿色的荧光物质，能与o2·-发生“氧化-水解”反应生成蓝色的荧光物质。因此本发明提供的探针能分别从绿色和蓝色两个通道实现对cys和o2·-的同时传感，为研究cys和o2·-的相关性提供了一个潜在的工具。
附图说明
[0021]
图1为化合物2的1h nmr图(cdcl3,600mhz)；
[0022]
图2为化合物2的
13
c nmr图(cdcl3,150mhz)；
[0023]
图3为化合物2的hrms图；
[0024]
图4为探针pycltp的1h nmr图(cdcl3,600mhz)；
[0025]
图5为探针pycltp的
13
c nmr图(cdcl3,150mhz)；
[0026]
图6为探针pycltp的hrms图；
[0027]
图7为探针在pbs中荧光光谱随时间(0-20min)的变化图；
[0028]
图8为探针pycltp与cys反应的荧光光谱图，(图8a)探针与cys反应的荧光强度随
时间的变化图；(图8b)探针对cys的荧光滴定图；(图8c)探针分别与cys、hcy和gsh反应的荧光光谱图；(图8d)探针分别与各种氨基酸(包括ala、arg、asp、gln、glu、his、ile、leu、lys、nac、phe、pro、ser、thr、try、tyr和val)反应的荧光光谱图；
[0029]
图9为探针pycltp与o2·-反应的荧光光谱图，(图9a)探针与o2·-反应的荧光强度随时间的变化图；(图9b)探针对o2·-的荧光滴定图；(图9c)探针分别与各种阴离子(包括f-、cl-、br-、i-、co
32-、po
32-、hpo
3-、so
32-、scn-)反应的荧光光谱图；(图9d)探针分别与各种ros(包括bo
3-、no、no
2-、s
2-、h2o2、naocl、ho
·
、ko2)反应的荧光光谱图；
[0030]
图10为本发明探针pycltp与cys和o2·-的传感机理示意图。
具体实施方式
[0031]
实施例1
[0032]
一种荧光探针，可以同时传感cys和o2·-，其结构式为：
[0033][0034]
一种可以同时传感cys和o2·-的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
(1)将吡啰红b(0.358g，1.0mmol)和kcn(0.195g，3.0mmol)加入10ml水中，回流18小时后，冷却至室温，过滤，用水洗涤。滤饼溶解在2.0m的hcl中(100ml)，逐滴加入到10ml的fecl3.6h2o(0.947g，3.5mmol)的2.0m的hcl溶液中，反应液在90℃时反应12h，然后冷却至室温，过滤，用水洗涤。滤饼溶解在50ml饱和的nahco3中，回流3天，冷却至室温有固体析出，过滤的粗品。粗产品经柱色谱(ch2cl2/meoh,50：1v/v)分离得亮黄色固体(0.134g，产率39.7％)。
[0036]1h nmr(600hz,cdcl3)8.10(d,j＝9.0hz,2h),6.65(dd,j1＝1.8hz,j2＝9.0hz,2h),6.69(s,2h),3.46(q,j＝7.2hz,8h),1.25(t,j＝7.2hz,12h)；
[0037]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ177.099,161.402,154.921,130.754,114.531,111.513,99.266,47.652,15.459；esi-ms:[m+h]
+
calcd for 339.2066,found 339.2067.
[0038]
(2)在n2保护下，将吡啰红酮(0.1g，0.3mmol)的ch3cn溶液在0℃搅拌10分钟，然后向上述溶液中逐渐滴加三氟甲基磺酸酐(200μl，1.2mmol)，反应液反应30分钟后加入4-氯苯硫酚(0.42g，3mmol)，混合物在室温下反应过夜。旋干溶剂，粗产品经柱色谱(ch2cl2/meoh＝20/1v/v)分离得到所述探针(65mg，产率44.3％)。
[0039]1h nmr(600hz,cdcl3)δ8.07(d,j＝13.8hz,2h),7.29(m,4h),6.91(m,4h),3.63(q,j＝9.0hz,8h),1.34(t,j＝9.6hz,12h).
[0040]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ157.2,155.7,153.1,134.5,132.7,131.1,130.3,115.6,114.5,96.9,46.3,12.7.esi-ms:[m]
+
calcd for465.1762,found 465.1761.
[0041]
实施例2
[0042]
1.测试溶液配制
[0043]
将探针用乙腈配成2mm的储存液，随后用20mm的pbs(ph 7.4)稀释至测试浓度。
[0044]
2.探针稳定性实验
[0045]
为了确保探针在pbs体系中的稳定性，首先将探针(1μm)置于比色皿中并在荧光光谱仪上连续扫描20分钟。如图7所示，探针在pbs中的发射波长为620nm，连续扫描20分钟后，荧光光谱未发生明显变化。上述结果表明，阳离子特性赋予了探针优良的水溶性且可以在pbs中稳定存在，该特性对于生物应用至关重要。
[0046]
3.探针与cys的反应性能研究
[0047]
在pbs体系中，选取450nm作为激发光时，pycltp(1μm)本身在620nm处具有微弱的红色荧光；当加入100μm的cys后，探针在620nm处的发射峰消失，在534nm处出现了一个新的发射峰，荧光强度约在15分钟时达到饱和，随后的实验均选取15分钟作为反应时间(图8a)。进一步的荧光滴定实验表明，随着cys浓度的增加，534nm处的荧光强度逐渐升高，当cys的浓度达到100μm时，荧光强度趋于稳定且增加92倍(图8b)。选择性实验表明，当向pycltp(1μm)中分别加入100μm的hcy、gsh以及其余常见氨基酸时，如我们预期的那样，仅有hcy可以引起534nm处荧光强度的增加(图8c)，其余氨基酸(包括gsh)均不会引发534nm处荧光强度的改变(图8d)。考虑到hcy在细胞内的浓度仅有12μm左右，其造成的影响可以忽略不计。因此，探针pycltp可以从绿色通道高选择性的传感cys。
[0048]
4.探针与o2·-的反应性能研究
[0049]
在pbs体系中，选取400nm作为激发光时，pycltp(1μm)本身在620nm处具有微弱的红色荧光；当加入300μm的o2·-后，探针在620nm处的发射峰消失，在450nm处出现了一个新的发射峰，荧光强度约在2分钟时达到饱和，随后的实验均选取2分钟作为反应时间(图9a)。进一步的荧光滴定实验表明，随着o2·-浓度的增加，450nm处的荧光强度逐渐升高，当o2·-的浓度达到200μm时，荧光强度趋于稳定且增加6.4倍(图9b)。选择性实验表明，当向pycltp(1μm)中分别加入200μm的各种阴离子以及活性氧化物时，上述化合物均不会引发450nm处荧光强度的改变(图9c和图9d)。因此，探针pycltp可以从蓝色通道高选择性的传感o2·-。
[0050]
综上所述，探针pycltp本身的发射峰在620nm处，当向探针的pbs溶液中分别加入cys和o2·-后，二者可以与探针分别发生“取代-重排”以及“氧化-水解”反应，生成了光物理性质完全不同的两个荧光物质，探针最终实现了对cys和o2·-从绿色和蓝色两个通道的同时传感(图9)。
[0051]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。