一种GSH-乏氧微环境双响应的自组装荧光探针及其制备方法和应用与流程

一种gsh-乏氧微环境双响应的自组装荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于化学成像材料领域，具体涉及一种gsh-乏氧微环境双响应的自组装荧光探针及其制备方法和应用，尤其涉及一种靶向效果好的gsh-乏氧微环境双响应的自组装荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.乏氧现象是肿瘤治疗和成像进展的主要障碍。由于诊断技术的敏感程度和选择性有限，许多癌症患者只有在恶性肿瘤形成后才能得到诊断，错过了最佳治疗时机。因此，开发有效的材料来针对性地检测和成像癌细胞中，对于肿瘤治疗领域的重要研究意义。尽管乏氧肿瘤细胞的一些异常行为给肿瘤治疗带来了困难，但乏氧肿瘤细胞的独特特性也为科学家设计新型纳米治疗药物提供了机会。近年来，随着越来越多的研究发现乏氧对各种肿瘤治疗方法的负面影响，(包括化疗、放疗和pdt)，人们也逐渐发现了许多策略可以克服这些障碍，并利用肿瘤乏氧的独特特性来提高目前应用的抗肿瘤诊断和治疗方法的效果。纳米材料的多功能特性使得在一个平台上实现影像引导治疗成为可能。结合纳米材料和乏氧反应策略的优势，有助于制定准确、个性化的实体瘤治疗方法。
3.在所有肿瘤成像的方法中，荧光成像因为简单、快速和灵敏度高的优点被广泛应用于生物医药领域，是一种非常重要且实用的成像方式。4-氯-7硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(nbd)是一种用途广泛的荧光分子，常用于作为蛋白、带有氨基官能团的纳米颗粒的标记物，但nbd本身也具有一些局限性，例如不具备靶向性，也没有体内自我聚集的能力，因此开发具备自组装能力的nbd材料在本领域研究中具备实际意义。
4.cn104478823a公开一种基于哌莫硝唑的荧光探针，其具有如下结构：
[0005][0006]
该荧光探针保留了赖氨酸主链上的伯氨基，有利于该分子后期与纳米颗粒等的结合，可以实现对末端为羧基的分子或纳米材料的荧光标记，可用于肿瘤细胞的荧光成像，为肿瘤细胞的检测和治疗提供有利帮助。但是，该分子并无乏氧靶向性，无法针对肿瘤乏氧区进行成像。
[0007]
由于现有荧光成像材料缺乏乏氧靶向的效果。因此，如何提供一种能够有效靶向乏氧肿瘤细胞的荧光成像材料，成为了亟待解决的问题。


技术实现要素：

[0008]
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种gsh-乏氧微环境双响应的自组装荧光探针及其制备方法和应用，尤其提供一种靶向效果好的gsh-乏氧微环境双响应的自组装荧光探针及其制备方法和应用。本发明提供的自组装荧光探针能够有效靶向乏氧肿瘤
区域，在gsh(还原性谷胱甘肽)和乏氧条件双重作用下能够发生自组装从而聚集发光，可进行乏氧选择性的成像，对肿瘤的检测和治疗提供有利帮助，且该材料对细胞无毒性，安全性高。
[0009]
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0010]
第一方面，本发明提供了一种gsh-乏氧微环境双响应的自组装荧光探针，所述自组装荧光探针的结构如式i所示：
[0011][0012]
上述特定结构的自组装荧光探针能够靶向乏氧肿瘤细胞，并且在肿瘤乏氧环境中高表达的还原性谷胱甘肽(gsh)和硝基还原酶(ntr)的共同作用下发生自组装聚集，从而发出荧光，实现乏氧选择性的成像，对肿瘤的检测和治疗提供有利帮助，且该材料对细胞无毒性，安全性高。
[0013]
第二方面，本发明提供了一种如上所述的自组装荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0014]
(1)将树脂活化，之后与fmoc-cys(stbu)-oh、缩合剂、有机碱混合反应，之后进行活性位点灭除、脱保护，得到第一肽链；
[0015]
(2)将步骤(1)得到的第一肽链依次与fmoc-phe-oh、fmoc-lys(boc)-oh在缩合剂和有机碱条件下反应，得到第二肽链；
[0016]
(3)将步骤(2)得到的第二肽链与硝基咪唑乙酸、缩合剂、有机碱混合反应，得到nikfc(stbu)，之后将树脂切割，得到nikfc-s肽段；
[0017]
(4)将步骤(3)得到的nikfc-s肽段与4-氯-7硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应，得到所述自组装荧光探针；
[0018]
反应路线如下：
[0019][0020]
上述方法通过采用固相合成方法能够有效合成所述自组装荧光探针。
[0021]
优选地，步骤(1)所述树脂包括2-氯三苯甲基氯树脂、王树脂或4-冰毒盐酸盐树脂中任意一种。
[0022]
优选地，步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)所述反应的时间独立地为0.8-1.2h，例如0.8h、0.9h、1h、1.1h或1.2h等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
[0023]
优选地，步骤(3)所述切割包括以下步骤：将nikfc(stbu)与三氟乙酸混合处理，之后抽滤、收集滤液，得到nikfc-s肽段。
[0024]
优选地，步骤(4)所述nikfc-s肽段与4-氯-7硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比为(0.9-1.1):(0.9-1.1)。
[0025]
优选地，步骤(4)所述反应的时间为12-24h。
[0026]
其中，nikfc-s肽段与4-氯-7硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比中，nikfc-s肽
段的份数可以是0.9、1或1.1等，4-氯-7硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的份数可以是0.9、1或1.1等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
[0027]
优选地，步骤(3)所述切割后、步骤(4)所述反应后独立地还进行纯化。
[0028]
优选地，所述缩合剂包括hbtu(苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐)、hobt(1-羟基苯并三唑)或tbtu(2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯)中任意一种。
[0029]
优选地，所述有机碱包括dipea(n,n-二异丙基乙胺)或dic(n,n'-二异丙基碳二亚胺)。
[0030]
第三方面，本发明还提供了一种如上所述的自组装荧光探针在制备细胞荧光成像材料中的应用。
[0031]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0032]
本发明提供了一种的自组装荧光探针，其能够靶向乏氧肿瘤细胞，并且在肿瘤乏氧环境中高表达的还原性谷胱甘肽(gsh)和硝基还原酶(ntr)的共同作用下发生自组装聚集，从而发出荧光，实现乏氧选择性的成像，对肿瘤的检测和治疗提供有利帮助，且该材料对细胞无毒性，安全性高。
附图说明
[0033]
图1是实施例1中的自组装荧光探针的核磁氢谱图；
[0034]
图2是实施例1中的自组装荧光探针的高分辨电喷雾质谱图；
[0035]
图3是实施例2中nikfc-nbd-s、nikfc-nbd、nikfc-nbd(normoxia)和nikfc-nbd(hypoxia)的液相色谱结果图；
[0036]
图4是实施例2中nikfc-nbd-s的质谱结果图；
[0037]
图5是实施例2中nikfc-nbd的质谱结果图；
[0038]
图6是实施例2中nikfc-nbd(normoxia)的质谱结果图；
[0039]
图7是实施例2中nikfc-nbd(normoxia)在1400左右的质谱结果图；
[0040]
图8是实施例2中nikfc-nbd(hypoxia)在710-715之间的质谱结果图；
[0041]
图9是实施例2中nikfc-nbd(hypoxia)在1400左右的质谱结果图；
[0042]
图10是实施例2中nikfc-nbd-s的tem图像；
[0043]
图11是实施例2中nikfc-nbd的tem图像；
[0044]
图12是实施例2中nikfc-nbd(normoxia)的tem图像；
[0045]
图13是实施例2中nikfc-nbd(hypoxia)的tem图像；
[0046]
图14是实施例2中nikfc-nbd(hypoxia)自组装后形成的纳米颗粒的粒径结果图；
[0047]
图15是实施例2中nikfc-nbd-s、nikfc-nbd、nikfc-nbd(normoxia)和nikfc-nbd(hypoxia)的荧光谱图；
[0048]
图16是实施例2中nikfc-nbd-s、nikfc-nbd、nikfc-nbd(normoxia)和nikfc-nbd(hypoxia)经紫外照射下的荧光发光图；
[0049]
图17是实施例3中对照组细胞成像图；
[0050]
图18是实施例3中实验组细胞成像图；
[0051]
图19是实施例4中常氧组荧光显微镜成像图；
[0052]
图20是实施例4中乏氧组荧光显微镜成像图。
具体实施方式
[0053]
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0054]
实施例1
[0055]
本实施例提供了一种自组装荧光探针的制备方法，具体步骤如下：
[0056]
(1)树脂活化：将0.4g 2-氯三甲基氯树脂放入固相合成管中，用5ml二氯甲烷(dcm)溶解。然后用氮气搅拌溶液10分钟。之后，用真空泵抽去树脂上的溶剂。然后再次添加5ml二氯甲烷(dcm)，并用氮气搅拌10分钟。随后，抽去液体，并用3ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)清洗(用氮气搅拌30s，然后真空泵抽去溶剂)，重复五次。
[0057]
(2)cys-树脂的合成：将0.8mmol的fmoc-cys(stbu)-oh溶解在3ml dmf中，然后向溶液中添加0.4ml的dipea。之后，将溶液添加到固相合成管中，并用氮气搅拌1h。反应后，抽去树酯上的溶剂并用3ml dmf洗涤5次。
[0058]
(3)活性位点封端：向固相合成管中加入5ml封端试剂(体积比dcm:meoh:dipea＝16:3:1)，用氮气搅拌10min，抽去溶剂。然后重复上述步骤一次。完成后，用3ml dmf清洗树脂5次。
[0059]
(4)cys的fmoc脱保护：向固相合成管中加入5ml脱保护溶剂(dmf中体积分数30％哌啶)，并与氮气搅拌30min。反应后，用3ml dmf洗涤树酯5次。
[0060]
(5)lys-phe-cys-树脂的合成：先将0.8mmol的fmoc-phe-oh和0.88mmol的hbtu溶解在3ml dmf中，然后添加0.4ml的dipea。之后，将溶液添加到固相合成管中，并用氮气搅拌1h。反应后，抽去溶剂并用3ml dmf洗涤5次。之后将0.8mmol的fmoc-lys(boc)-oh和0.88mmol的hbtu溶解在3ml dmf中，然后添加0.4ml的dipea。之后，将溶液添加到固相合成管中，并用氮气搅拌1h。反应后，抽去溶剂并用3ml dmf洗涤5次。fmoc对lys的脱保护步骤与cys相同。
[0061]
(6)ni-lys-phe-cys树脂的合成：将1.2mmol的硝基咪唑乙酸和1.32mmol的hbtu溶解在3ml dmf中，然后添加0.4ml的dipea。将溶液加入固相合成管中，并与氮气搅拌1h。反应后，抽去溶剂，并分别用3ml dmf、dcm、meoh和正己烷(每种溶剂五次)清洗。
[0062]
(7)多肽切割：向固相合成管中加入10ml三氟乙酸(tfa)进行切割。首先在0℃下切割树脂30分钟，然后在20℃下切割30分钟。切割完成后，抽去并收集溶液，然后用氮气浓缩过滤。
[0063]
(8)沉淀：向无水乙醚中缓慢滴加浓缩过滤后的tfa溶液得到沉淀，然后过滤沉淀，得到浅黄色粉末状固体，这是反应的粗产物。粗产物经高效液相色谱纯化(以水:乙腈＝70:30体积比为初始梯度，0:100体积比为终止梯度进行梯度淋洗)，最终得到白色粉末状固体nikfc-s肽段。
[0064]
(9)连接nbd：将nikfc-s肽段(63.7mg，0.1mmol)溶于甲醇(1.2ml)和水(1ml)的混合溶剂中，加入na2co3(27.8mg，0.2mmol)调节溶液的ph至8，搅拌溶液至其变为澄清。在此之后，将nbd-cl(20mg，0.1mmol)溶于0.4ml的甲醇之中，并将nbd-cl的甲醇溶液缓慢滴加入之前混合好的nikfc-s肽段的溶液中，在20℃下搅拌反应12小时。反应结束后，通过旋转蒸发
的方法去除体系内的甲醇，随后，用hcl溶液将溶液的ph调节至3，再通过离心(7500rpm
×
5min)沉淀、过滤去除水，得到粗产物，其为红褐色固体。将粗产物通过hplc分离纯化(以水:乙腈＝50:50体积比为初始梯度，0:100体积比为终止梯度进行梯度淋洗)后，得到式i的自组装荧光探针，表征数据如下：1h nmr(400mhz,dmso)δ8.50(d,j＝4.4hz,1h),8.48(d,j＝3.2hz,1h),8.23(d,j＝8.0hz,1h),8.10(d,j＝8.4hz,1h),7.60(d,j＝0.8hz,1h),7.23(m,5h),7.18(d,j＝0.8hz,1h),5.11(s,2h),4.56-4.54(m,1h),4.51-4.47(m,1h)4.38-4.33(m,1h),3.13-3.09(dd,j＝5.2hz,3.2hz,1h),3.08-3.03(dd,j＝3.2hz,4.0hz,1h),3.00-2.95(dd,j＝3.6hz,4.4hz,1h),2.81-2.75(dd,j＝5.6hz,6.4hz,1h),2.69-2.66(m,2h),1.68-1.60(m,2h),1.56-1.50(m,2h),1.40-1.35(m,2h),1.29-1.22(s,9h).ms:calculated for ni-kfc[(m+h)+]:801.24；observed esi-ms:m/z 801.24。核磁氢谱如图1所示，高分辨电喷雾质谱如图2所示。
[0065]
实施例2
[0066]
本实施例中，通过以下方法进行实施例1中的自组装荧光探针的gsh-乏氧双响应自组装验证：
[0067]
向25μm的实施例1中的自组装荧光探针(记为nikfc-nbd-s)的pbs缓冲液(ph＝7.4)加入250μm的gsh并在37℃孵育1h(产物记为nikfc-nbd)。随后，在37℃向该溶液中通氮气10min，以去除氧气。随后，在保证反应管封闭的前提下停止氮气流，用注射器将nadph的pbs溶液(2mg/ml，0.1ml)以及硝基还原酶(0.1mg/ml，0.1ml)加入该溶液中，然后再次开启氮气流，在37℃下鼓氮气30min。结束后，用封口膜将反应管封好，于37℃培养箱放置24小时，得到乏氧环境下的nikfc-nbd(记为nikfc-nbd(hypoxia))。作为对照，保持常氧条件，并对nikfc-nbd-s进行上述同样还原酶反应步骤(不进行通氮气步骤)，得到对照组常氧环境下的nikfc-nbd(记为nikfc-nbd(normoxia))。随后对其几组实验进行液相色谱和质谱的分析(图3-9)，通过tem和dls表征nikfc-nbd-s在gsh-乏氧双响应作用下自组装的结构变化(图10-14)，以及采用多功能荧光光谱仪(fluoromax)进行结构变化导致的荧光谱图验证(图15-16)。
[0068]
其中图3为nikfc-nbd-s、nikfc-nbd、nikfc-nbd(normoxia)和nikfc-nbd(hypoxia)的液相色谱结果，可以发现，随着gsh的加入和乏氧环境下硝基还原酶的作用，nikfc-nbd-s、nikfc-nbd、nikfc-nbd(normoxia)和nikfc-nbd(hypoxia)四者的液相色谱出峰位置也在发生变化，说明nikfc-nbd-s结构在gsh和ntr作用下发生了变化。
[0069]
图4-6分别为nikfc-nbd-s、nikfc-nbd、nikfc-nbd(normoxia)的质谱结果图，可以发现nikfc-nbd-s在gsh作用下，得到的产物nikfc-nbd质谱结果与nikfc-nbd-s的确存在差异，两者结构不同；图7为nikfc-nbd(normoxia)的质谱结果在1400左右的图像，可以发现其中不存在质谱结果为1422附近的峰，图8为nikfc-nbd(hypoxia)在710-715之间的质谱结果图，可以发现其中不存在nikfc-nbd，而在1400左右的图像中(图9)，存在质谱结果为1422.45的峰，且该结果与上述自组装荧光探针二聚体的理论出峰一致。由此可以明显判断nikfc-nbd-s在乏氧环境下，经ghs和ntr双重作用，其结构发生变化，并自组装形成了二聚体。
[0070]
进一步，图10-13分别为nikfc-nbd-s、nikfc-nbd、nikfc-nbd(normoxia)和nikfc-nbd(hypoxia)的tem图像，可以发现，在图10-12(图10-12中白色线段均指其长度为100nm)
中仅能观察到杂质黑点，而图13中即可观察到nikfc-nbd(hypoxia)自组装后形成的纳米颗粒，其粒径结果如图14所示。
[0071]
图15为nikfc-nbd-s、nikfc-nbd、nikfc-nbd(normoxia)和nikfc-nbd(hypoxia)的荧光谱图，图16为nikfc-nbd-s、nikfc-nbd、nikfc-nbd(normoxia)和nikfc-nbd(hypoxia)经紫外照射下的荧光发光图。可以发现，经过自组装的形成的nikfc-nbd(hypoxia)荧光强度显著高于其他组。
[0072]
上述结果充分证明了本发明提供的自组装荧光探针在乏氧环境下，经ghs和ntr双重作用下能够形成具有高荧光强度的荧光材料，说明了其gsh-乏氧微环境双响应的特性。
[0073]
实施例3
[0074]
在本实施例中，通过以下方法进行nikfc-nbd-s的细胞毒性检测，具体包括以下步骤：
[0075]
向实验组hela细胞培养板中加入100μl的80μmol/l的nikfc-nbd-s(实验组)，并设置对照组，其中，对照组中为有且仅有细胞的培养基，无任何其他材料。24h后，弃去培养基，将两组细胞分别加入含有10％cck-8的溶液，并在37℃培养箱下孵育约1小时。之后对细胞进行成像，结果如图17-18所示。从图中可以发现实验组(图18)中细胞形态与对照组(图17)中相似，且无死亡细胞，可以发现本发明提供的自组装荧光探针具有对细胞无毒性，安全性高的优点。
[0076]
实施例4
[0077]
在本实施例中，通过以下方法进行nikfc-nbd-s的细胞成像，具体包括以下步骤：
[0078]
将hela细胞分为常氧和乏氧两组，按分组接种于两个不同的六孔板的14mm爬片中，放入37℃培养箱孵育24h。然后使用olmpus倒置荧光显微镜成像，激光器波长488nm。
[0079]
nikfc-nbd-s分子对hela细胞成像的结果如图19-20所示，可以发现乏氧组(图20)中细胞内出现明显的荧光信号，而常氧组(图19)中则无明显荧光信号，证明了nikfc-nbd-s分子具有较好的细胞成像能力。
[0080]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明自组装荧光探针及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0081]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0082]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。