一种提高山药多糖的免疫活性硒化修饰方法及其应用

1.本发明属于生物医药领域，涉及一种提高山药多糖的免疫活性硒化修饰方法以及硒化山药多糖在制备药品或保健品中的应用。


背景技术：

2.近年来，大量天然来源多糖被提取和开发，它们在膳食引发的代谢疾病方面表现了良好的治疗效果。多糖可以调节肠道微生物群落结构，降低厚壁菌门（firmicutes）和拟杆菌门（bacteroides）的比例，降低变形菌门（proteobacteria）的相对丰度。多糖被肠道菌群利用后，动态调节肠道菌群的多样性、组成和分布，并通过调控上皮组织ifn-γ、il-4、il-17和tgf-β的分泌调节肠道微环境，增强机体免疫。
3.硒(se)是一种具有生物功能的微量矿物质，对人类健康具有非常重要的影响。硒通过改变至少30种硒蛋白的表达来影响人体重要的生理功能，如谷胱甘肽过氧酶、硫氧还蛋白还原酶和碘胸腺嘧啶去碘化酶。这些硒酶具有抗氧化作用，调节甲状腺激素代谢和免疫系统功能，提高精子的生产和质量，预防癌症等生理功能。此外，硒还能通过维持细胞膜结构的完整性来提高免疫功能。因此，硒具有很强的营养价值和药用价值。
4.硒多糖是有机硒中含量较高、活性较强的一类物质，不仅集硒与多糖的优点于一身，还体现出硒与多糖结合为硒多糖后的生物学功能。大量研究表明，硒多糖在免疫调节、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血压、降血脂等方面发挥越来越多的作用，对其生物活性的研究备受关注。
5.山药多糖在降血糖血脂、保肝护肝、抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化、抗衰老、神经保护、调节肠道菌群等方面表现出良好的药理活性。但硒化山药多糖在调节肠道菌群增强免疫力方面的研究尚未见报道。


技术实现要素：

6.本发明设计了一种提高山药多糖的免疫活性的硒化修饰方法及其应用，其解决的技术问题是如何使硒对山药多糖进行修饰并且使得生理和药理功能得到优化，如何通过调节肠道菌群提高机体免疫功能。
7.为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：一种提高山药多糖的免疫活性的硒化修饰方法，包括以下步骤：步骤1、山药多糖的提取；步骤2、山药多糖的硒化。
8.优选地，步骤1、山药多糖的提取中包括以下步骤：步骤11、怀山药根茎部分粉碎；步骤12、提取山药多糖提取液；步骤13、山药多糖提取液浓缩后进行醇沉；步骤14、山药多糖除蛋白。
9.优选地，怀山药根茎部分，先粉碎，过20目筛，按料液比1:25混合，80℃微波提取20分钟；将多糖水溶液降压浓缩到1/5体积后加入4倍体积的乙醇，静置过夜；离心收集沉淀，按料液比1:20加水复溶，按照多糖水溶液、乙醇、硫酸铵质量比5.159：2.811：2.03的比例配
置成乙醇/硫酸铵双水相体系，静止过夜，随后收集下相溶液，透析后冷冻干燥得到山药多糖。
10.优选地，步骤2、山药多糖的硒化包括以下步骤：步骤21、山药多糖溶解添加反应催化剂；步骤22、添加na2seo3生成硒化多糖；步骤23、调节ph后透析；步骤24、依次浓缩、冷却、冷冻和干燥后得到硒化山药多糖。
11.优选地，将500mg山药多糖溶解于50ml硝酸溶液(0.6%,v/v)，放在磁力搅拌器上使多糖完全溶解；再加入浓度为0.05g/ml的na2seo
3 8ml，70℃恒温1000r/min搅拌反应6h；冷却至室温后用碳酸氢钠调节ph至5-6，5000r/min离心5分钟，取上清用1000da透析袋透析48h；将硒化多糖溶液用旋转蒸发仪浓缩，待冷却至室温后，倒入培养皿中放入-20℃冰箱进行冷冻，最后将冷冻好的样品放入冷冻干燥机中干燥48h，得到硒化山药多糖。
12.多糖溶解于硝酸溶液是为了给硒化反应提供合适的反应条件，硝酸是多糖硒化反应中的催化剂。
13.由于多糖中含有大量羟基，羟基是一种两性基团，酸性条件下得质子呈阳性，碱性条件下失质子呈阴性，在ph 5-6溶液中相对比较稳定，因此硒化反应完成后需要将ph调到5-6之间。
14.一种硒化山药多糖，使用上述的硒化修饰方法制备。
15.上述的硒化山药多糖在制备免疫增强剂药物或保健品中的应用。
16.上述的硒化山药多糖在制备调节肠道菌群药物或保健品中的应用。
17.上述的硒化山药多糖在制备调节细胞因子含量的药物中的应用。
18.上述的硒化山药多糖在提高环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠免疫力的中的应用。
19.该提高山药多糖的免疫活性的硒化修饰方法及其应用具有以下有益效果：（1）本发明公开了硒化山药多糖在制备抗氧化、和提高免疫力的药物或保健品中的应用，硒和山药结合后利用其协同作用提高了山药多糖的抗氧化能力和免疫力，降低了无机硒的毒性，其效果优于亚硒酸钠或山药多糖，对提高动物抗应激能力和机体免疫力具有重要意义。
20.（2）本发明硒化山药多糖在制备保健品或药物中的应用，研究发现对山药多糖进行结构修饰制备成硒化多糖，能够调节肠道菌群，因此可用于制备抗氧化或提高免疫能力的药物或保健品。
附图说明
21.图1为小鼠血清中tnf-α，的含量图(
±
s，n=12)， *p＜0.05，**p＜0.01vs model。
22.图2为小鼠血清中il-6的含量图(
±
s，n=12)，*p＜0.05，**p＜0.01vs model。
23.图3为小鼠脾脏指数图(
±
s，n=12)，*p＜0.05，**p＜0.01vs model。
24.图4为小鼠胸腺指数图(
±
s，n=12)，*p＜0.05，**p＜0.01vs model。
25.图5为山药多糖和硒化山药多糖对小鼠巨噬细胞tnf-α的分泌量(
±
s，n=3)，*p＜0.05，**p＜0.01vs control。
26.图6为山药多糖和硒化山药多糖对小鼠巨噬细胞il-6的分泌量(
±
s，n=3)，*p＜0.05，**p＜0.01vs control。
27.nc是正常对照组normal control的缩写，其腹腔注射剂为生理盐水；lps是脂多
糖，是tlr4受体激动剂，作用于raw264.7细胞时可以激发免疫应答。
具体实施方式
28.下面结合图1至图6，对本发明做进一步说明：实施例1：硒化山药多糖的制备：1. 山药多糖的提取；a、粉碎：怀山药根茎部分，先粉碎，过20目筛；b、提取：山药和水按料液比1:25混合，80℃微波提取20分钟；c、醇沉：步骤b中山药多糖提取液浓缩后加入4倍体积乙醇，静止过夜；d、除蛋白：离心收集步骤c中山药多糖，按料液比1:20加水复溶，与乙醇、硫酸铵按照质量比5.159：2.811：2.03的比例配置成乙醇/硫酸铵双水相体系，静止过夜，随后收集下相溶液，透析后冷冻干燥得到山药多糖。
29.山药多糖的硒化将500mg山药多糖溶解于50ml硝酸溶液(0.6%,v/v)，放在磁力搅拌器上使多糖完全溶解，再加入浓度为0.05g/ml的na2seo
3 8ml，70℃恒温1000r/min搅拌反应6h，冷却至室温后用碳酸氢钠调节ph至5-6，5000r/min离心5分钟，取上清用1000da透析袋透析48h。将硒化多糖溶液用旋转蒸发仪浓缩，待冷却至室温后，倒入培养皿中放入-20℃冰箱进行冷冻，最后将冷冻好的样品放入冷冻干燥机中干燥48h，得到硒化山药多糖。
30.试验例1 ：硒化山药多糖对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的影响：小鼠按体重均衡随机分为5组(n=12): 正常对照组(生理盐水)、环磷酰胺组(cpa)、山药多糖组(yp)、亚硒酸钠组(se)和硒化山药多糖(se-yp)组。除对照组外，其余各组小鼠于实验第二天单次腹腔注射cpa 50 mg/kg，空白组注射生理盐水，连续注射5天，制备免疫低下小鼠模型。正常对照及模型组给与同等体积的生理盐水，硒化多糖组灌胃给药0.1mg/kg（以硒计算），亚硒酸钠组的剂量是0.1mg/kg（以硒计算），山药多糖组给与对应硒多糖组的多糖，连续灌胃14d，第14d给药12h后，摘眼球取血，分离血清按照elisa试剂盒说明书测定血清中tnf-α，il-6的含量。
31.取血完毕后托颈椎处死小鼠，取出胸腺和脾脏，精密称重后，按下列公式计算各组小鼠的胸腺指数和脾脏指数。
32.胸腺（脾脏）指数=胸腺（脾脏）重/体重（mg/10g）如图1和图2所示，硒化山药多糖组小鼠的脾脏指数高于山药多糖组和亚硒酸钠组，显著高于模型组；硒化山药多糖组小鼠的胸腺指数高于模型组、山药多糖组和亚硒酸钠组，差异不显著。
33.试验例3：硒化山药多糖对raw264.7巨噬细胞分泌细胞因子的影响取生长良好、对数生长期的raw264.7巨噬细胞，吸去培养液，加入2 ml预热的pbs清洗残留的培养液，重复两次，然后用冷的pbs进行处理，2 min后进行吹打，制成浓度为1
×
106个/ml的细胞悬液，接种在无菌的96孔细胞培养板中，每孔加入100 μl，在5% co2、37℃的培养箱中贴壁培养12 h，分别加入100μl dmem（含10% 胎牛血清和1%双抗）培养液和含不同浓度的na2seo3、（0.5，1.5，3μg/ml）山药多糖和硒化山药多糖（50, 250, 500μg/ml）的培养液，以lps（10μg/ml）为阳性对照。每组设3个复孔，置于5% co2、37℃的培养箱中培养，培
养24 h，离心(170
×
g, 10 min)，收集培养液上清。参照试剂盒说明书用elisa试剂盒测定raw264.7巨噬细胞分泌细胞因子的分泌量。
34.图4-图6所示，硒化山药多糖可诱导raw264.7巨噬细胞分泌tnf-α和il-6，具有明显的量效关系。tnf-α分泌量接近于lps组，略高于山药多糖组，远高于亚硒酸钠组和空白组；il-6分泌量低于lps组，略高于山药多糖组，远高于亚硒酸钠组和空白组。
35.上面结合附图对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。