一株皮特不动杆菌、酯化液、处理黄浆水的方法与应用与流程

1.本发明涉及酿酒技术领域，尤其涉及一株皮特不动杆菌、酯化液、处理黄浆水的方法与应用。


背景技术：

2.浓香型白酒产销量均占70％左右。其窖香浓郁、绵甜甘冽、香味协调、尾净余长，深受广大消费者的喜爱。研究表明，白酒中约2％的呈香呈味物质是决定酒体质量的重要物质。在香味物质中，酯类成分是其中的重要组成部分，而酯类物质的合成主要是通过酯化反应产生，其实质就是酸和醇反应，脱水而生成酯，此反应主要在参与白酒酿造微生物体内温和的环境中进行，且这一过程需有酯化酶的参与完成。浓香型白酒的主体香味物质是己酸乙酯，在窖内发酵过程中，其生成周期较长，产己酸乙酯量低，且成本高，成为浓香型白酒生产的一个技术难题。
3.在浓香型白酒酿造过程中产酯化酶的菌株包括真菌、细菌、酵母菌，其中霉菌以红曲霉、根霉和毛霉等为主，酵母菌主要是生香酵母为主，而在细菌中报道较少(主要为芽孢杆菌)。因此，筛选高效合成己酸乙酯的细菌菌株具有重要的应用潜力。
4.黄浆水中含有丰富的残余淀粉、还原糖和大量的有机酸，其中乙酸、丁酸和乳酸的含量最为丰富，若不经过处理直接排放，不仅会污染环境，而且会造成资源浪费。目前黄浆水可通过大曲制备出酯化液，然后利用串蒸工艺混合在酒体中。然而目前常常存在酯化液己酸乙酯含量低且含乳酸乙酯的特点。
5.因此有必要开发出在黄浆水环境高效催化合成己酸乙酯的菌株及处理黄浆水的方法。


技术实现要素：

6.本发明提供一种了通过筛选纯化过程获得高产己酸乙酯菌株皮特不动杆菌，本发明所述皮特不动杆菌具有高效催化合成己酸乙酯的能力，专一性强，几乎不产其他酯类，且能应用于处理黄浆水中。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一株皮特不动杆菌，拉丁文名为acinetobacter pittii；保藏编号为cgmcc no.24023，菌株代码为tghsd zwhg08。
9.本发明还提供了所述皮特不动杆菌在产己酸乙酯中的应用。
10.本发明进一步提供了一种酯化液，包括所述皮特不动杆菌发酵上清液、混合酸、乙醇和水。
11.优选的，所述混合酸为己酸、乙酸、丁酸和乳酸；所述己酸、乙酸、丁酸和乳酸的体积比为1～3：1～3：1～3：1～3；
12.所述皮特不动杆菌发酵上清液、混合酸、乙醇和水的体积比为20～30：4～8：20～30：70～80。
13.优选的，所述皮特不动杆菌发酵上清液的制备方法为：将所述皮特不动杆菌接种于液体培养基中培养得发酵液，将发酵液离心，收集上清为皮特不动杆菌发酵上清液。
14.优选的，所述液体发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：牛肉膏15～30g/l、氯化钙1～2g/l、蔗糖35～70g/l、七水硫酸镁1～3g/l；所述液体发酵培养基的ph为6.5～7.5；
15.所述离心的转速为2500～3500r/min；所述离心的时间为13～17min；
16.所述皮特不动杆菌的接种比例为1～5
×
106个/ml；
17.所述培养时间为2～4d；所述培养温度为34～38℃。
18.本发明进一步提供了所述的酯化液的制备方法，将混合酸与乙醇混合，得混合物1，将混合物1与水混合，得混合物2，将混合物2与所述皮特不动杆菌发酵上清液混合酯化。
19.优选的，所述酯化温度为30～36℃；所述酯化时间为5～9d。
20.本发明还进一步的提供了一种处理黄浆水的方法，包括如下步骤：将黄浆水、酒尾、窖泥培养液、香醅和所述酯化液混合，恒温培养。
21.优选的，所述黄浆水、酒尾、窖泥培养液、香醅和酯化液的质量比为20～30：65～75：1～2：1～2：1.5～2.5；
22.所述恒温培养时间为25～35d；所述恒温培养温度为30～36℃。
23.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
24.1、本发明筛选出高产己酸乙酯的菌株-皮特不动杆菌，且首次报道该种菌种具有合成己酸乙酯的能力；
25.2、本发明所述皮特不动杆菌发酵液中所含的产酯酶具有高度的专一性，几乎不产其他酯类，只产少量的己酸乙酯；
26.2、本发明所述皮特不动杆菌能应用于处理黄浆水，黄浆水进行酯化后得其酯化液，增加酯化液的己酸乙酯含量，具有提高酒质的潜力。所以其不仅能有效处理黄浆水对环境的污染，还达到了资源高值化利用的目的。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
28.图1为所述皮特不动杆菌菌种的平板照片；
29.图2为所述皮特不动杆菌菌种16srdna序列27f端测序部分峰图(200～300pb范围)；
30.图3为所述皮特不动杆菌菌种16srdna序列1492r端测序部分峰图(200～300pb范围)；
31.图4为所述皮特不动杆菌菌种16srdna序列的ncbi比对结果。
32.生物保藏说明
33.皮特不动杆菌，拉丁文名为acinetobacter pittii；
34.该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心：地址为：北京市
朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年12月02日，保藏编号为cgmcc no.24023。
具体实施方式
35.本发明提供了一株皮特不动杆菌，拉丁文名为acinetobacter pittii；保藏编号为cgmcc no.24023。该菌株的菌落呈白色凸起，表面光滑、湿润。
36.本发明还提供了所述皮特不动杆菌在产己酸乙酯中的应用。
37.本发明进一步提供了一种酯化液，包括所述皮特不动杆菌发酵上清液、混合酸、乙醇和水。
38.在本发明中，所述混合酸为己酸、乙酸、丁酸和乳酸；所述己酸、乙酸、丁酸和乳酸的体积比为1～3：1～3：1～3：1～3；优选为1～2：1～2：1～2：1～2；进一步优选为2：2：2：1～2；更优选为1：1：1：1。
39.在本发明中，所述皮特不动杆菌发酵上清液、混合酸、乙醇和水的体积比为20～30：4～8：20～30：70～80；优选为22～28：5～7：22～28：72～78；进一步优选为24～26：6：24～26：74～76；更优选为25：6：25：75。
40.在本发明中，所述皮特不动杆菌发酵上清液的制备方法为：将所述皮特不动杆菌接种于液体培养基中培养得发酵液，将发酵液离心，收集上清为皮特不动杆菌发酵上清液。
41.在本发明中，所述液体发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：牛肉膏15～30g/l、氯化钙1～2g/l、蔗糖35～70g/l、七水硫酸镁1～3g/l；优选为牛肉膏20～25g/l、氯化钙1.5g/l、蔗糖50～60g/l、七水硫酸镁1.5～2.5g/l；进一步优选为牛肉膏22～23g/l、氯化钙1.5g/l、蔗糖54～56g/l、七水硫酸镁2g/l；更优选为牛肉膏22.5g/l、氯化钙1.5g/l、蔗糖55g/l、七水硫酸镁2g/l。
42.在本发明中，所述液体发酵培养基的ph为6.5～7.5；优选为6.7～7.3；进一步优选为6.9～7.1；更优选为7。
43.在本发明中，所述离心的转速为2500～3500r/min；优选为2700～3300r/min；进一步优选为2900～3100r/min；更优选为3000r/min。
44.在本发明中，所述离心的时间为13～17min；优选为14～16min；进一步优选为15min。
45.在本发明中，所述皮特不动杆菌的接种比例为1～5
×
106个/ml；优选为2～4
×
106个/ml；进一步优选为3
×
106个/ml。
46.在本发明中，所述培养时间为2～4d；优选为3d。
47.在本发明中，所述培养温度为34～38℃；优选为35～37℃；进一步优选为36℃。
48.本发明进一步提供了所述的酯化液的制备方法，将混合酸与乙醇混合，得混合物1，将混合物1与水混合，得混合物2，将混合物2与所述皮特不动杆菌发酵上清液混合酯化。
49.在本发明中，所述酯化温度为30～36℃；优选为31～35℃；进一步优选为32～34℃；更优选为33℃。
50.在本发明中，所述酯化时间为5～9d；优选为6～8d；进一步优选为7d。
51.本发明还进一步的提供了一种处理黄浆水的方法，包括如下步骤：将黄浆水、酒尾、窖泥培养液、香醅和所述酯化液混合，恒温培养。
52.在本发明中，所述黄浆水、酒尾、窖泥培养液、香醅和酯化液的质量比为20～30：65
～75：1～2：1～2：1.5～2.5；优选为22～28：67～73：1.5：1.5：1.7～2.3；进一步优选为24～26：69～71：1.5：1.5：1.9～2.1；更优选为25：70：1.5：1.5：2。
53.在本发明中，所述恒温培养时间为25～35d；优选为27～33d；进一步优选为29～31d；更优选为30d。
54.在本发明中，所述恒温培养温度为30～36℃；优选为31～35℃；进一步优选为32～34℃；更优选为33℃。
55.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
56.以下实施例所用到的滴定法为：
57.(1)30％无水乙醇：30ml无水乙醇于100ml容量瓶中，定容至100ml，混合均匀；
58.(2)0.1mol/lnaoh溶液：称取氢氧化钠4g，加少量蒸馏水溶解，定容至1000ml，混合均匀；
59.(3)0.1mol/l h2so4溶液：量取5.43ml浓硫酸，在不断搅拌下缓缓加到适量水中，冷却后稀释至1000ml，混合均匀；
60.(4)测定酯化酶方法：加入1.5ml己酸，再加入无水乙醇25ml，充分摇匀后加入纯水75ml，再次充分摇匀震荡。称取酶液25ml加入混好液体的锥形瓶中，摇匀震荡后，用透明封口膜扎紧，与此同时做空白试验按照同样的顺序操作，但其中的酶液，用115℃高压蒸汽灭菌20min后的酶液取代，其他试剂及操作步骤保持不变。
61.最后将实验组和对照组的酯化酶样品锥形瓶按顺序放入恒温培养箱内中保温酯化7天，同时做好标记。提前组装好蒸馏装置，洗净，将酯化7天后的菌液，倒入250ml蒸馏烧瓶中，用30％的无水乙醇少量多次洗涤酯化酶样品的锥形瓶，洗涤后的液体一起倒入烧瓶中，以保证实验的准确性，收集装置处，采用50ml容量瓶收集蒸馏出的液体，容量瓶放在烧杯中，烧杯放入适量的冰水，然后开始蒸馏，当小容量瓶的液体接近50ml刻线时，将容量瓶放入恒温箱中保温，温度保持在20度，将容量瓶中的液体的充分混匀后，以备后续使用。
62.将上一步蒸馏出来的液体保持温度20℃后，倒入250ml具塞烧杯中，再加入几滴酚酞后，用现配naoh溶液(0.1mol/l)中和滴定，记录下消耗溶液的量，然后再量取加25ml氢氧化钠溶液，倒入具塞烧瓶，充分的震荡摇匀，然后放入沸水煮沸30分钟，加热后，等具塞烧杯的液体冷却到室温，然后用配置好的硫酸溶液(0.1mol/l)滴定，当红色消失时，记录消耗h2so4的量。
63.计算公式如下：
64.(1)试样的总酯含量(以己酸乙酯为例)
[0065][0066]
a＝ai-a0
[0067]
50——实验酯化样品的体积，单位毫升ml；
[0068]
25.0——单位为毫升ml，皂化时加入氢氧化钠溶液的体积(0.1mol/l)；
[0069]
0.142——与1.00ml氢氧化钠溶液相当的以克表示的己酸乙酯的质量；
[0070]
a——单位为克每升，实验试样总酯的含量；
[0071]
ai——单位为克每升，未扣除空白试样所测总酯的含量；
[0072]
a0——单位为克每升，空白试验所测总酯含量，
[0073]
ci——单位为摩尔每升，硫酸滴定溶液的浓度；
[0074]
c——单位为摩尔每升，氢氧化钠溶液的浓度；
[0075]
v1——单位为毫升ml，消耗h2so4(0.1mol/l)的体积；
[0076]
(2)样品的酯化力y＝a
×
50
×2[0077]
2——曲酶活单位的折算系数；
[0078]
y——试样的酯化力，单位为u；
[0079]
50——取样体积，单位为毫升；
[0080]
a——馏出液的总酯，单位为克每升；
[0081]
实施例1
[0082]
一种筛选高产己酸乙酯皮特不动杆菌的方法，步骤如下：
[0083]
(1)取窖泥样品1.0g，在无菌条件下加入99ml带有玻璃珠的无菌水中，摇匀，制备成10-2
稀释液，再分别稀释成10-3
、10-4
、10-5
、10-6
的稀释液，取各梯度稀释液100μl涂布于选择培养基上，30℃倒置培养3d；
[0084]
(2)从选择培养基上筛选挑取获得10株水解圈较大的菌株(编号为tg-1～tg-10)，平板上划线分离至纯种，将筛选得到的菌株编号并保藏于20％的甘油管中，置于-20℃冰箱中保存；
[0085]
(3)将划线筛选出的纯种菌接入装有lb固体培养基的斜面中，置于30℃恒温培养箱中培养3d；
[0086]
(4)将初筛获得的菌株制备为种子，按照浓度1
×
106个/ml接种于装有液体发酵培养基的三角瓶中，并置于36℃恒温摇床，以180r/min培养3d；
[0087]
(5)取发酵液20ml加到50ml的离心管，在离心机中3000r/min，离心15min后，取上清液采用滴定法测定菌株的酯化力，结果如表1所示。经测定得到tg-3，tg-5，tg-6，tg-9这四株菌的酯化力较高。
[0088]
其中，所述选择培养基配方以1l计：乳化液90ml，橄榄油3.5ml，硝酸钠2g/l，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，葡萄糖12g/l，琼脂16g/l，其余为水，自然ph。
[0089]
筛选培养基配方为：鱼粉蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，酵母浸粉6.5g/l，琼脂30g/l，其余为水，ph7.0。
[0090]
液体发酵培养基配方为：牛肉膏30g/l，氯化钙2g/l，蔗糖70g/l，七水硫酸镁3g/l其余为水，ph 7.5。
[0091]
表1菌株的酯化力结果比较
[0092]
[0093][0094]
实施例2
[0095]
将实施例1筛选出的tg-3，tg-5，tg-6，tg-9这四株菌接入装有lb固体培养基的斜面中，置于30℃恒温培养箱中培养3d；
[0096]
(2)将四株菌斜面菌种接种于装有液体培养基的锥形瓶中，放入36℃恒温摇床，以180r/min培养3d；
[0097]
(3)取发酵液20ml加到50ml的离心管，在离心机中3000r/min，离心15min后，上清液即为酶液；
[0098]
(4)分别取1.5ml己酸、乙酸、丁酸、乳酸和四种酸的混合酸(1:1:1:1)，加入25ml无水乙醇，摇匀后，再加入纯水75ml，摇匀振荡，再分别加入25mltg-3，tg-5，tg-6，tg-9这四株菌的上清液，摇匀振荡，用封口膜扎紧，放入恒温箱酯化7d，制作出不同酸的酯化液；
[0099]
(5)将酯化液进行气相检测菌株产己酸乙酯的能力，气相色谱分析结果数据如表2所示。经检测得到tg-3号所述皮特不动杆(扩增序列如seq no:3所示)产己酸乙酯能力最强，且在混合酸酯化专一性较强。
[0100]
其中，液体发酵培养基配方为：牛肉膏20g/l，氯化钙2g/l，蔗糖60g/l，七水硫酸镁1.5g/l其余为水，ph 6.5。
[0101]
表2四株菌的酯化液的气相色谱分析结果(g/100ml)
[0102]
[0103][0104]
实施例3
[0105]
提取完菌株dna后，进行pcr扩增：利用通用引物进行序列扩增:
[0106]
基因扩增采用细菌通用引物扩增。
[0107]
引物序列分别是上游引物(27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3')(如seq no：1所示)；
[0108]
下游引物(1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3')(如seq no：2所示)。
[0109]
20μlpcr反应体系包括：2.0μl的10
×
ex taq buffer，0.2μl的5u ex taq，1.6μl的2.5mm dntp mix，1μl的引物1/引物2(序列1和序列2)，0.5μl的dna模板，13.7μl的ddh2o。
[0110]
扩增条件为:95℃预变性5min，进入循环，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环，最,72℃延伸1.5min。所得产物用试剂盒纯化，克隆入，鉴定出阳性菌落进行测序。
[0111]
利用一代测序平台3730对扩增产物进行测序，每个样品测序得到.abl格式的峰图文件如图2(27f端测序部分峰图)和图3(1492r端测序部分峰图)所示。一般测序两端的序列质量较差，通过质量剪切去除两端测序低质量的序列，对质控后的双端测序结果进行组装，组装得到16s rrna序列或26s rdna。
[0112]
ncbi数据库比对确认种属：用样品的组装序列去进行数据库比对，根据比对结果的覆盖度，相似性等进行判断，确定样本的种属。一般情况下，选取比对得分最高的，如图4所示。
[0113]
实施例4
[0114]
一种处理黄浆水的方法，步骤如下：将黄浆水、酒尾、窖泥培养液、香醅和酯化液混合，30℃恒温培养25d；
[0115]
所述黄浆水、酒尾、窖泥培养液、香醅和酯化液的质量比为20：65：1：1：1.5；
[0116]
所述酯化液的制备方法为，将混合酸与乙醇混合，得混合物1，将混合物1与水混合，得混合物2，将混合物2与所述皮特不动杆菌发酵上清液混合30℃酯化5d；
[0117]
所述酯化液中tg-3发酵上清液、混合酸、乙醇和水的体积比为20：4：20：70；所述混合酸为己酸、乙酸、丁酸和乳酸，体积比为1：3：3：3；
[0118]
所述皮特不动杆菌发酵上清液的制备方法为：将所述皮特不动杆菌接种(接种比例为1
×
106个/ml)于液体培养基中34℃培养2d得发酵液，将发酵液2500r/min离心13min，收集上清为皮特不动杆菌发酵上清液；
[0119]
所述液体发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：牛肉膏15g/l、氯化钙1g/l、蔗糖35g/l、七水硫酸镁1g/l；所述液体发酵培养基的ph为6.5。
[0120]
实施例5
[0121]
一种处理黄浆水的方法，步骤如下：将黄浆水、酒尾、窖泥培养液、香醅和酯化液混合，36℃恒温培养35d；
[0122]
所述黄浆水、酒尾、窖泥培养液、香醅和酯化液的质量比为30：75：2：2：2.5；
[0123]
所述酯化液的制备方法为，将混合酸与乙醇混合，得混合物1，将混合物1与水混合，得混合物2，将混合物2与所述皮特不动杆菌发酵上清液混合36℃酯化9d；
[0124]
所述酯化液中皮特不动杆菌发酵上清液、混合酸、乙醇和水的体积比为30：8：30：80；所述混合酸为己酸、乙酸、丁酸和乳酸，体积比为3：1：1：1；
[0125]
所述皮特不动杆菌发酵上清液的制备方法为：将所述皮特不动杆菌接种(接种比例为5
×
106个/ml)于液体培养基中38℃培养4d得发酵液，将发酵液3500r/min离心17min，收集上清为皮特不动杆菌发酵上清液；
[0126]
所述液体发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：牛肉膏30g/l、氯化钙2g/l、蔗糖70g/l、七水硫酸镁3g/l；所述液体发酵培养基的ph为7.5。
[0127]
实施例6
[0128]
一种处理黄浆水的方法，步骤如下：将黄浆水、酒尾、窖泥培养液、香醅和酯化液混合，33℃恒温培养30d；
[0129]
所述黄浆水、酒尾、窖泥培养液、香醅和酯化液的质量比为25：70：1.5：1.5：2；
[0130]
所述酯化液的制备方法为，将混合酸与乙醇混合，得混合物1，将混合物1与水混合，得混合物2，将混合物2与所述皮特不动杆菌发酵上清液混合33℃酯化7d；
[0131]
所述酯化液中皮特不动杆菌发酵上清液、混合酸、乙醇和水的体积比为25：6：25：75；所述混合酸为己酸、乙酸、丁酸和乳酸，体积比为1：1：1：1；
[0132]
所述皮特不动杆菌发酵上清液的制备方法为：将所述皮特不动杆菌接种(接种比例为3
×
106个/ml)于液体培养基中36℃培养3d得发酵液，将发酵液3000r/min离心15min，收集上清为皮特不动杆菌发酵上清液；
[0133]
所述液体发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：牛肉膏22.5g/l、氯化钙1.5g/l、蔗糖55g/l、七水硫酸镁2g/l；所述液体发酵培养基的ph为7。
[0134]
实施例7
[0135]
对比试验：对所述皮特不动杆菌的酯化能力与传统的曲粉进行比较。
[0136]
以实施例5作为实验组；
[0137]
对照组：其他方法与实施例3相同，区别仅在于，将酯化液替换为汤沟大曲曲粉。
[0138]
实验组和对照组分别处理完成后，对实验组和对照组处理后的黄浆水分别进行乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯的含量检测，结果如表3所示。
[0139]
表3检测结果(g/100ml)
[0140][0141]
由此可见，通过本发明方法处理得到的黄浆水，其己酸乙酯得到大幅提升，其酯化效果要明显优于传统的曲粉。
[0142]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。