一种用于检测半胱氨酸的诺蒎酮基比率型荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属精细有机合成技术领域，涉及一种用于检测半胱氨酸的诺蒎酮基比率型荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.半胱氨酸是一种人体必需的氨基酸，在代谢、调节氧化还原稳态、蛋白质合成、解毒、细胞信号转导等方面发挥重要作用。然而，体内半胱氨酸水平异常会引起特定的疾病，如神经毒性、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、帕金森病等。因此，开发一种具有高灵敏性和选择性的半胱氨酸检测方法具有重要意义。
3.目前已报道的检测方法有几种，包括电化学分析、比色法和高效液相色谱法。但这些检测方法存在样品制备复杂、灵敏度不高、检测时间长等缺点。相比之下，荧光探针检测方法因其反应快、灵敏度高、选择性独特、操作简便而得到广泛应用。利用3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物为原料合成新型的半胱氨酸比率荧光探针，暂无相关报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种检测半胱氨酸的诺蒎酮基比率型荧光探针3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物，能满足使用需求。本发明所要解决的另一技术问题是提供3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物的制备方法。本发明还要解决一个技术问题是提供一种上述检测半胱氨酸的诺蒎酮基比率型荧光探针的应用。
5.为实现解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
6.检测半胱氨酸的诺蒎酮基比率型荧光探针为3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物，其结构式为：
[0007][0008]
所述的3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物的制备方法，包括如下步骤：
[0009]
1)3-乙酰基诺蒎酮与对羟基苯甲醛进行羟醛缩合反应，得到3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮；
[0010]
2)3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮与三氟化硼-乙醚进行络合反应，得到3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物；
[0011]
3)3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物与丙烯酰氯进行酯化反应，
得到3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物；
[0012]
具体反应式为：
[0013][0014]
步骤1)中，3-乙酰基诺蒎酮与对羟基苯甲醛进行羟醛缩合反应，得到3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮，具体步骤如下：
[0015]
(1)将10～20mmol 3-乙酰基诺蒎酮、5～10mmol三氧化二硼、10～20mmol对羟基苯甲醛和10～20mmol硼酸三丁酯依次加入100～200ml乙酸乙酯中，60～80℃下反应30～60min，然后滴加5～30μl正丁胺，继续反应15～20h。反应液冷却至60℃后加入0.4m盐酸调节溶液ph至中性搅拌30～60min；
[0016]
(2)反应完成后，加入蒸馏水洗涤反应溶液。得到的有机溶液用无水硫酸钠干燥、过滤、蒸馏，得到3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮粗产物；
[0017]
(3)3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮粗产物经硅胶色谱柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10∶1，v/v)后，得到淡黄色固体3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮。
[0018]
步骤2)中，3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮与三氟化硼-乙醚进行络合反应，得到3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物，具体步骤如下：
[0019]
(1)将2～4mmol 3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮和3～6mmol三氟化硼-乙醚加入30～60ml二氯甲烷中，40℃下反应12h；
[0020]
(2)反应完成后冷却至室温，反应液经减压蒸馏除去二氯甲烷后，在正己烷中重结晶、干燥，得到淡黄色固体3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物。
[0021]
步骤3)中，3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物与丙烯酰氯进行酯化反应，得到3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物，具体步骤如下：
[0022]
(1)将2～4mmol 3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物、4～8mmol三乙胺和5～10mmol丙烯酰氯加入20～40ml无水二氯甲烷中，室温下反应5h；
[0023]
(2)反应液经蒸馏除去溶剂后，得到3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物粗产物；
[0024]
(3)3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物粗产物粗产物经硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10∶1，v/v)，得到3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物。
[0025]
所述的3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物在检测半胱氨酸中的应用。
[0026]
所述的3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物为检测半胱氨酸的诺蒎酮基比率型荧光探针，能够专一性的识别水溶液中的半胱氨酸，在365nm紫外
光照射下，溶液荧光由蓝色变为黄绿色。
[0027]
有益效果：与现有技术相比，本发明利用诺蒎酮为起始原料，制备出新型的3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物，能专一性的识别半胱氨酸，在365nm紫外光照射下，溶液的荧光由蓝色变为黄绿色，作为检测半胱氨酸的荧光探针具有合成简单、识别专一、灵敏度高、响应迅速等优点，其中，对半胱氨酸的检测极限达到2.1
×
10-7
mol/l，响应时间为2min，具有良好的应用前景。
附图说明
[0028]
图1是3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物与不同浓度半胱氨酸作用的荧光光谱图；
[0029]
图2是3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物与不同金属离子、阴离子以及氨基酸作用的荧光光谱图。
具体实施方式
[0030]
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0031]
实施例1
[0032]
3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物的制备方法，反应式为：
[0033][0034]
具体步骤如下：
[0035]
1)3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮的制备：
[0036]
将10mmol 3-乙酰基诺蒎酮、5mmol三氧化二硼、10mmol对羟基苯甲醛和10mmol硼酸三丁酯依次加入100ml乙酸乙酯中，80℃下反应30min，然后滴加30μl正丁胺，继续反应20h。反应液冷却至60℃后加入0.4m盐酸调节溶液ph至中性，搅拌30min；反应完成后，用蒸馏水洗涤反应溶液。有机溶液用无水硫酸钠干燥、过滤、蒸馏，得到3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮粗产物；3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮粗产物经硅胶色谱柱层析后(石油醚/乙酸乙酯＝10/1，v/v)，得到淡黄色固体3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮，得率为67％。1h nmr(600mhz，dmso-d6)δ：14.75(s，1h)，9.95(s，1h)，7.56(d，j＝8.2hz，2h)，7.42(d，j＝15.7hz，1h)，6.80(d，j＝8.3hz，2h)，6.70(d，j＝15.7hz，1h)，2.72(dd，j＝15.3，3.3hz，1h)，2.65-2.61(m，1h)，2.57(dt，j＝10.6，5.9hz，1h)，2.41(t，j＝5.5hz，1h)，2.31-2.27(m，1h)，1.35(d，j＝10.0hz，1h)，1.32(s，3h)，0.85(s，3h)；
13
c nmr(150mhz，dmso-d6)δ：208.69，168.26，159.83，138.86，130.45，126.82，116.27，115.86，104.24，54.54，39.54，39.51，27.76，26.20，26.02，21.73；hrms(m/z)：[m+h]
+ calcd for c
18h20
o3+h
+
，285，1491；
found，285.1494。
[0037]
2)3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物的制备：
[0038]
将2mmol 3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮和3mmol三氟化硼-乙醚加入30ml二氯甲烷中，40℃下反应12h；反应完成后冷却至室温，反应液经减压蒸馏除去二氯甲烷后，在正己烷重结晶、干燥，得到淡黄色固体3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物，得率为52％。1h nmr(600mhz，dmso-d6)δ：10.42(s，1h)，7.93(d，j＝15.4hz，1h)，7.83-7.76(m，2h)，6.96(d，j＝15.4hz，1h)，6.90-6.83(m，2h)，2.83(dd，j＝15.2，3.2hz，1h)，2.69(tt，j＝8.5，4.2hz，2h)，2.63(t，j＝5.4hz，1h)，2.37(tt，j＝5.7，3.0hz，1h)，1.39(d，j＝7.6hz，4h)，0.85(s，3h)；
13
c nmr(150mhz，dmso-d6)δ：198.25，175.34，161.63，147.34，132.32，128.34，125.55，116.17，113.57，104.25，49.87，40.06，38.99，28.07，25.19，25.02，21.07；hrms(m/z)：[m+h]
+ calcd for c
18h19
bf2o3+h
+
，333.1474；found，333.1469。
[0039]
3)3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物的制备：
[0040]
将2mmol 3-(3-(4-羟苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物、4mmol三乙胺和5mmol丙烯酰氯加入20ml无水二氯甲烷中，室温下反应5h。反应液经蒸馏除去溶剂后，得到3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物粗产物。3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物粗产物经硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/1，v/v)，得到3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物，得率为56％。1h nmr(600mhz，dmso-d6)δ：8.03-7.98(m，3h)，7.35-7.30(m，2h)，7.21(d，j＝15.6hz，1h)，6.57(dd，j＝17.3，1.2hz，1h)，6.43(dd，j＝17.3，10.4hz，1h)，6.19(dd，j＝10.4，1.2hz，1h)，2.89(dd，j＝15.4，3.2hz，1h)，2.76-2.68(m，3h)，2.39(tt，j＝5.9，2.9hz，1h)，1.43(d，j＝9.8hz，1h)，1.40(s，3h)，0.87(s，3h)；
13
c nmr(150mhz，dmso-d6)δ：201.08，175.04，164.31，153.17，145.69，134.54，132.60，131.48，127.93，122.99，118.45，105.84，50.66，40.56，39.34，28.36，25.64，25.40，21.58；hrms(m/z)：[m+na]
+ calcd for c
18h19
bf2o3+na
+
，409.1399；found，409.1399。
[0041]
实施例2
[0042]
将3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物溶于(ph＝7.2，10mm，四氢呋喃/水，5/5(v/v))中配制成1
×
10-5
m的溶液，将半胱氨酸分别溶于pbs缓冲液中配成浓度为0、5、10、25、40、55、70、85、100、120、150、200μm的溶液。采用荧光光谱滴定法在荧光分光光度计上测得不同浓度的半胱氨酸对3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物的荧光发射光谱，如图1所示。结果表明，在365nm紫外光照射下，随着水溶液中半胱氨酸浓度的逐渐增加，溶液的蓝色荧光逐渐消失，绿色荧光逐渐增强。由此说明，该化合物可作为灵敏性检测半胱氨酸的荧光探针，检测极限达到2.1
×
10-7
mol/l，响应时间为2min。
[0043]
实施例3
[0044]
将3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物溶于pbs缓冲液(ph＝7.2，10mm，四氢呋喃/水，5/5(v/v))中配制成1
×
10-5
m的溶液，同时将不同金属离子、阴离子以及氨基酸溶于pbs缓冲液中配成浓度为1
×
10-4
m的溶液。采用荧光光谱滴定法在荧光分光光度计上测得不同金属离子、阴离子以及氨基酸对3-(3-((4-丙烯酰氧基)苯基)丙烯酰基)诺蒎酮二氟化硼络合物的荧光发射光谱，如图2所示。结果表明，半胱氨酸的加入能
使水溶液体系的蓝色荧光消失而绿色荧光增强，而加入其他分析物如hcy，gsh，thr，arg，tyr，leu，val，trp，gly，ala，na
+
，cu
2+
，ni
2+
，mg
2+
，cd
2+
，ca
2+
，i-，hso
3-，hpo
42-，so
32-，no
3-，no
2-，hco
3-，co
32-等对比参照观察，溶液的荧光光谱并没有发生显著的变化。由此说明，该化合物可以作为专一性识别半胱氨酸的荧光探针。