一种dsRNA表达框及载体的制作方法

本发明属于基因工程领域和生物农药领域，具体涉及一种基因表达框，尤其是一种用于高效合成dsrna的表达框、以及包含该表达框的载体。

背景技术：

1、rnai在基因沉默方面具有简便、高效的优势，是基因功能研究的重要工具。利用rnai技术可抑制靶标基因的转录与表达，这种功能丢失(lof)的研究方法比传统的功能获得(gof)方法更具优势，可用于模拟药物作用。因此，rnai在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具。同时，那些在靶标实验中证明有效的sirna/shrna本身还可以被进一步开发成为rnai药物。

2、在药物标靶发现和确认方面，rnai技术已获得了广泛的应用。如果所用基因属于可用药的靶标，例如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌到细胞外，就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选。在疾病治疗方面，双链小分子rna或sirna已被用于多种疾病的临床测试性治疗，如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等。在抗病毒治疗方面，帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用rna干扰疗法。在肿瘤治疗方面rna干扰方法也已经取得了一些重要进展和成果。

3、此外，rnai技术还被用于农业病虫害防治领域，rna生物农药能够特异沉默目的基因的表达，具有效率高、专一性强的特点。其原理是利用生物体内源功能基因特异的片段，在体外合成之后导入目标物种体内，抑制基因的表达，从而阻碍基因的功能的发挥，并最终影响目标物种的生长发育、直至死亡的机制。因其具有目标物种专一性、靶标开发便捷性和易于降解等特性，具备了绿色农药所需要的绝大多数功能，引起了众多科学家和农药公司的关注，被称为农药生产史上的第三次革命。当前，国际上很众多农药公司，例如拜耳-孟山都、陶氏益农和先正达等都在利用该技术，投入大量的人力和物力进行有针对性的杀虫剂研发，据报道，已经有相应的产品上市或者即将上市。

4、基于喷洒型的rna生物农药的大规模应用，最为核心的问题是靶标基因筛选和规模化生产，目前常用的生产方式为利用ht115-l4440表达生产dsrna，然而质粒l4440表达产率较低，严重影响了rna生物农药的应用。

技术实现思路

1、为了克服生产dsrna的现有技术的缺陷，促进rnai技术的广泛应用，发明人对于dsrna的表达系统进行了优化，构建出可高效合成dsrna的表达框和载体。为实现上述目的，本发明包含如下技术方案。

2、一种基因表达框，其包括：基因模板dna序列，也可称为货物基因(cargo gene)、靶标基因(target gene)等；对称地相向设置于所述基因模板dna序列两端的相同启动子；与所述启动子反向相连的串联终止子，所述串联终止子包括两个以上互不相同的终止子。这种表达框是一种dna分子，可以表达的任意长短的基因片段，包括但不限于各种大小的dsrna。

3、上述基因表达框的结构形式一般为：

4、ter1-ter2-…-tern-启动子-模板dna-启动子-tern-…-ter2-ter1，

5、其中，ter是终止子terminator的简写，n为2以上的自然数，是终止子ter的编号，如图1所示。

6、优选n为2或3，即该基因表达框结构形式为：

7、ter1-ter2-启动子-cargo gene-启动子-ter2-ter1，或者

8、ter1-ter2-ter3-启动子-cargo gene-启动子-ter3-ter2-ter1。

9、在一种实施方式中，上述启动子可以是t7启动子(seq id no.4)，也可以是其他rna聚合酶iii型启动子比如u6启动子、h1启动子、thl启动子、200-1启动子、1200-9-15启动子等等，但不限于此。

10、优选地，上述终止子可以选自vsv终止子(seq id no.1，ter1)、t7u终止子(seq idno.2，ter2)、t7终止子(seq id no.3，ter3)、t3终止子和sp6终止子等，但不限于此。

11、一种优选的实施方式中，上述基因模板dna序列(cargo gene)一侧的ter1-ter2-ter3-t7的序列是seq id no.5，而另一侧的t7-ter3-ter2-ter1的序列是seq id no.6。这种分子结构的表达框特别适合于表达dsrna双链分子，合成效率很高。

12、优选地，上述表达框中，所述基因模板dna序列在两端还引入限制性内切酶位点，以方便进行后续目标基因(target gene)的替换。

13、上述在基因模板dna序列两端引入的限制性内切酶包括、但不限于nhei、ncoi、ecori、hindiii、psti、bamhi、xhoi、kpni、bglii、saci、xbai、xhoi、noti等。酶切位点依据目标基因的序列进行选择，避免在序列内部具有同样的酶切位点。

14、上述待表达的目标基因(target gene)可以是dsrna基因，所述的基因模板dna序列是dsrna转录模板。

15、例如，上述dsrna基因序列可以是seq id no.7。该基因转录合成的dsrna可以高效率地靶向棉铃虫基因组中羧酸酯酶(carboxyleterase)基因car，本文中称为dscar。

16、本发明的第二个目的在于提供一种重组质粒，质粒载体上包含上述的基因表达框，如图2所示。

17、当待表达的目标基因(target gene)是dsrna基因时，质粒优选是puc57质粒，重组质粒可简称为pt7pro，能高效合成出dsrna比如上述dscar。本领域技术人员容易理解，上述的基因表达框可以克隆到任何质粒载体上，用于在合适的宿主细胞中表达目的基因。

18、因此，本发明的另一个目的在于提供上述的基因表达框、上述的重组质粒在表达外源基因比如dsrna中的用途。

19、实验证明，pt7pro表达载体能够显著提高dsrna的合成产量，可以作为体外大量生产dsrna的模板。本发明通过上述基因工程手段，对puc57载体进行改造，获得了pt7pro重组质粒，并利用棉铃虫羧酸酯酶carboxylesterase(car)基因对这一系统进行了测试。结果表明，本发明构建的pt7pro-dscar-ht115(de3)生产系统，极大地提高了dsrna的产率，比l4440-ht115(de3)产率(1.30μg/ml菌液)(ma et al.,2020)提高了2.3倍(3.0μg/ml菌液)。

技术特征：

1.一种基因表达框，其特征在于，包括：基因模板dna序列；对称地相向设置于所述基因模板dna序列两端的相同启动子；与所述启动子反向相连的串联终止子，所述串联终止子包括两个以上互不相同的终止子。

2.如权利要求1所述的基因表达框，其特征在于，其结构形式为：ter1-ter2-…-tern-启动子-模板dna-启动子-tern-…-ter2-ter1，其中n为2以上的自然数。

3.如权利要求1所述的基因表达框，其特征在于，所述启动子是t7启动子(seq idno.4)，并且/或者所述终止子选自vsv终止子(seq id no.1)、t7u终止子(seq id no.2)、t7终止子(seq id no.3)。

4.如权利要求3所述的基因表达框，其特征在于，所述基因模板dna序列一侧的ter1-ter2-ter3-启动子的序列是seq id no.5，另一侧的启动子-ter3-ter2-ter1的序列是seqid no.6。

5.如权利要求1所述的基因表达框，其特征在于，所述基因模板dna序列在两端还引入限制性内切酶位点。

6.如权利要求1所述的基因表达框，其特征在于，所述的基因是dsrna基因，所述的基因模板dna序列是dsrna转录模板。

7.如权利要求6所述的基因表达框，其特征在于，所述dsrna基因序列是seq id no.7。

8.一种重组质粒，其特征在于，质粒载体上包含如权利要求1-7中任一项所述的基因表达框。

9.如权利要求8所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒载体是puc57质粒。

10.如权利要求1-7中任一项所述的基因表达框、如权利要求8或9所述的重组质粒在表达外源基因中的用途。

技术总结
本发明公开了一种基因表达框，其包括：基因模板DNA序列；对称地相向设置于所述基因模板DNA序列两端的相同启动子；与所述启动子反向相连的串联终止子，所述串联终止子包括两个以上互不相同的终止子。本发明还公开了包含上述基因表达框的重组质粒，可以高效合成dsRNA。

技术研发人员：苗雪霞,李海超,关若冰
受保护的技术使用者：上海植生优谷生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15