一种TaqDNA聚合酶单克隆抗体及其应用的制作方法

一种taq dna聚合酶单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于抗体技术领域，具体涉及一种taq dna聚合酶单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.taq dna聚合酶因其具有极高的热稳定性和5
’‑3’
外切活性，广泛应用于taqmen探针的qpcr反应体系中。taq dna聚合酶的扩增速率约60nt/秒，在1分钟的退火和延伸条件下，经30-40个循环，1.5-2小时可获得大量的pcr产物。为缩短pcr的运行时间，大多数研究者将退火与延伸合并为一步，使pcr扩增程序由原来的三步转变为两步。虽缩短了将近一半的时间，但却降低了灵敏度。
3.随着快速pcr仪的开发，pcr仪的升降温速率大大提高，使pcr的运行时间再次缩短，但还是受限于taq dna聚合酶的扩增速率。《compartmentalized self-replication under fast pcr cycling conditions yields taq dna polymerase mutants with increased dna-binding affifinity and blood resistance》文献研究，对taq dna聚合酶一个或多个位点的突变，可以显著提高taq dna聚合酶的扩增速率，同时增强taq dna聚合酶对血液的耐受性。
4.然而无论野生型taq dna聚合酶还是突变型taq dna聚合酶在低温条件下都是有活性的，就会导致基于taq dna聚合酶配制的pcr反应试剂在偏离正常保存条件下性能的不稳定性。热启动酶是利用taq dna聚合酶的抗体封闭其聚合活性位点以降低其低温条件下的非特异性扩增。那么对于其外切活性也可以通过用抗体进行封闭以维持其在低温条件下的稳定性。因此如何制备高效封闭taq dna聚合酶的单克隆抗体是本领域的研究重点。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种可以有效封闭taq dna聚合酶的外切活性位点单克隆抗体及其应用。
6.本发明所采取的技术方案是：根据ncbi p19821.1 taq dna聚合酶的蛋白序列，突变其g59w/v155i/e507k三个氨基酸序列后，合成基因序列构建至pet28a载体中，诱导表达突变型taq dna聚合酶蛋白，纯化后，免疫小鼠。利用杂交瘤技术制备具有分泌抗体的杂交瘤细胞，筛选出阳性杂交瘤细胞并进行单克隆。制备腹水并进行抗体纯化。经对taq dna聚合酶5'-3'外切活性封闭测试，筛选出可以封闭taq dna聚合酶5'-3'外切活性的高灵敏度抗体。最终筛选出2株单克隆抗体，分别是杂交瘤细胞株f10-21(保藏编号：cctcc no:c202272)，杂交瘤细胞株f10-22(保藏编号：cctcc no:c202273)。
7.本发明的第一方面，提供一种taq dna聚合酶单克隆抗体，所述单克隆抗体为f10-21或f10-22；所述f10-21包含f10-21轻链可变区和f10-21重链可变区；所述f10-21轻链可变区包含cdr1、cdr2、cdr3；
8.所述f10-21轻链可变区cdr1的氨基酸序列为：
9.a)seq id no.1；或
10.b)seq id no.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
11.所述f10-21轻链可变区cdr2的氨基酸序列为：
12.a)seq id no.2；或
13.b)seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
14.所述f10-21轻链可变区cdr3的氨基酸序列为：
15.a)seq id no.3；或
16.b)seq id no.3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
17.所述f10-21重链可变区cdr1的氨基酸序列为：
18.a)seq id no.4；或
19.b)seq id no.4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
20.所述f10-21重链可变区cdr2的氨基酸序列为：
21.a)seq id no.5；或
22.b)seq id no.5所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
23.所述f10-21重链可变区cdr3的氨基酸序列为：
24.a)seq id no.6；或
25.b)seq id no.6所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
26.所述f10-22包含f10-22轻链可变区和f10-22重链可变区；所述f10-22轻链可变区包含cdr1、cdr2、cdr3；
27.所述f10-22轻链可变区cdr1的氨基酸序列为：
28.a)seq id no.7；或
29.b)seq id no.7所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
30.所述f10-22轻链可变区cdr2的氨基酸序列为：
31.a)seq id no.2；或
32.b)seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
33.所述f10-22轻链可变区cdr3的氨基酸序列为：
34.a)seq id no.3；或
35.b)seq id no.3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
36.所述f10-22重链可变区cdr1的氨基酸序列为：
37.a)seq id no.8；或
38.b)seq id no.8所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰
后且功能相同或相似的氨基酸序列；
39.所述f10-22重链可变区cdr2的氨基酸序列为：
40.a)seq id no.9；或
41.b)seq id no.9所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
42.所述f10-22重链可变区cdr3的氨基酸序列为：
43.a)seq id no.10；或
44.b)seq id no.10所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
45.在本发明的一些实施方式中，
46.所述f10-21包含f10-21轻链可变区和f10-21重链可变区；
47.所述f10-21轻链可变区的氨基酸序列为：
48.a)seq id no.11；或
49.b)seq id no.11所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
50.所述f10-21重链可变区的氨基酸序列为：
51.a)seq id no.12；或
52.b)seq id no.12所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
53.所述f10-22包含轻链可变区和重链可变区；
54.所述f10-22轻链可变区的氨基酸序列为：
55.a)seq id no.13；或
56.b)seq id no.13所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
57.所述f10-22重链可变区的氨基酸序列为：
58.a)seq id no.14；或
59.b)seq id no.14所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
60.在本发明的一些实施方式中，所述f10-21由保藏编号为cctcc no:c202272的杂交瘤细胞株f10-21产生，所述f10-22由保藏编号为cctcc no:c202273的杂交瘤细胞株f10-22产生。
61.本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包括本发明第一方面所述的单克隆抗体的编码基因。
62.本发明的第三方面，提供一种载体，所述核酸分子包含本发明第二方面所述的核酸分子。
63.本发明的第四方面，提供一种细胞，所述细胞包含本发明第三方面所述的载体。
64.本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述单克隆抗体或本发明第二方面所述核酸分子或本发明第三方面所述载体或本发明第四方面所述细胞在(1)～(8)至少一项中的应用：
65.(1)降低taq dna聚合酶的非特异性扩增；
66.(2)制备降低taq dna聚合酶的非特异性扩增的产品；
67.(3)保证taq dna聚合酶的热稳定性；
68.(4)制备保证突变型taq dna聚合酶的热稳定性的产品；
69.(5)dna扩增；
70.(6)制备dna扩增相关产品；
71.(7)pcr反应；
72.(8)制备pcr相关产品。
73.本发明的第六方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的细胞。
74.在本发明的一些实施方式中，所述产品中还包含taq dna聚合酶。
75.在本发明的一些实施方式中，所述taq dna聚合酶和单克隆抗体的质量比为1:1.5～1:2。
76.在本发明的一些实施方式中，所述产品为试剂盒。
77.本发明的有益效果是：
78.本发明中提供了两种可高效封闭taq dna聚合酶5'-3'外切活性的高灵敏度抗体f10-21和f10-22，特异性强，封闭效果好，有利于维持pcr反应试剂在扩增前的稳定性，实用价值高；而且提供了生产f10-21和f10-22的杂交瘤细胞株，可制备大量高效封闭taq dna聚合酶的单克隆抗体。
附图说明
79.图1为抗体筛选初始荧光值与终点荧光值柱状图。
80.图2为实施例4中的pcr扩增曲线图。
81.图3为f10-21、f10-22抗体封闭野生型taq dna聚合酶外切活性测试图。
具体实施方式
82.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
83.实施例1单克隆抗体制备
84.根据ncbi p19821.1 taq dna聚合酶的蛋白序列：mrgmlplfepkgrvllvdghhlayrtfhalkglttsrgepvqavygfaksllkalkedgdavivvfdakapsfrheayggykagraptpedfprqlalikelvdllglarlevpgyeaddvlaslakkaekegyevriltadkdlyqllsdrihvlhpegylitpawlwekyglrpdqwadyraltgdesdnlpgvkgigektarklleewgsleallknldrlkpairekilahmddlklswdlakvrtdlplevdfakrrepdrerlraflerlefgsllhefgllespkaleeapwpppegafvgfvlsrkepmwadllalaaarggrvhrapepykalrdlkeargllakdlsvlalreglglppgddpmllaylldpsnttpegvarryggewteeageraalserlfanlwgrlegeerllwlyreverplsavlahmeatgvrldvaylralslevaeeiarleaevfrlaghpf
nlnsrdqlervlfdelglpaigktektgkrstsaavlealreahpivekilqyreltklkstyidplpdlihprtgrlhtrfnqtatatgrlsssdpnlqnipvrtplgqrirrafiaeegwllvaldysqielrvlahlsgdenlirvfqegrdihtetaswmfgvpreavdplmrraaktinfgvlygmsahrlsqelaipyeeaqafieryfqsfpkvrawiektleegrrrgyvetlfgrrryvpdlearvksvreaaermafnmpvqgtaadlmklamvklfprleemgarmllqvhdelvleapkeraeavarlakevmegvyplavplevevgigedwlsake(seq id no.19)；
85.突变其g59w/v155i/e507k三个氨基酸序列后，合成基因序列构建至pet28a载体中。采用分子生物学方法表达突变型taq dna聚合酶蛋白。免疫8-10周龄，重约20g，健康的balb/c的雌性小鼠。末次免疫第三天处死小鼠，并体外分离脾细胞。脾细胞与骨髓瘤细胞按5:1-10:1比例进行细胞融合并接种于96孔板中。用hta培养基筛选出杂交瘤细胞。用elisa方法筛选出阳性杂交瘤细胞，并进行两轮单克隆培养。共筛选出30株单克隆。将30株单克隆扩大培养后，一部分进行冻存，一部分接种于小鼠腹腔内。接种10天后，采集腹水。用亲和层析法纯化腹水，获得30个单克隆抗体。
86.实施例2突变型taq dna聚合酶外切活性抗体筛选
87.以m13 taqmen探针的pcr试剂为例：
88.上游引物：gattctggcgtaccgttcct(seq id no.20)；
89.下游引物：aacgtgctttcctcgttgga(seq id no.21)；
90.探针：rox-cggcctcctgtttagctcccg-bhq2(seq id no.22)。
91.实施例1中，纯化出的30个抗体，分别调整浓度为1.6mg/ml。
92.按表1配制基础反应液：
93.表1反应体系
94.试剂名称用量(μl)10x pcr buffer22.5mm dntp1.510umol/l上游引物110umol/l下游引物110umol/l探针0.5突变型taq dna聚合酶(0.4mg/ml)3m13 dna5水4.5
95.以上配制31份，其中1份加入1.5μl抗体储存液作为对照组(即无抗体组)，剩余30份分别加入1.5μl待检测的30个抗体。
96.按照下列程序收集实时荧光。
[0097][0098]
实验结果如表2与图1所示：
[0099]
表2各实验组初始荧光值与终点荧光值汇总表
[0100][0101]
从表2与图1结果来看，对照组(即无抗体组)，经48℃孵育2h后，荧光值由860.24增长至1383.10，荧光增幅1.61倍。说明突变型taq dna聚合酶在此阶段发挥其外切酶活性切割探针释放荧光信号。而f10-21、f10-22组荧光值分别由881.31、869.73增长至914.90、916.85，荧光增幅分别增长1.04倍、1.05倍。说明f10-21、f10-22抗体封闭了突变型taq dna聚合酶的外切活性位点，有效地阻断了其外切活性。其他抗体荧光增幅1.11倍～1.39倍，说明有封闭突变型taq dna聚合酶的外切活性位点的功能，但不能完全封闭，效果不如f10-21、f10-22。
[0102]
将产生f10-21、f10-22的杂交瘤细胞保藏于国家保藏中心，其中产生f10-21的杂交瘤细胞株的保藏编号为cctcc no:c202272、保藏时间20220313、分类命名：杂交瘤细胞株f10-21；产生f10-22的杂交瘤细胞株的保藏编号为cctcc no:c202273、保藏时间20220313、分类命名：杂交瘤细胞株f10-22。
[0103]
实施例3
[0104]
对f10-21和f10-22进行序列分析：
[0105]
其中f10-21包含f10-21轻链可变区和f10-21重链可变区；所述f10-21轻链可变区包含cdr1、cdr2、cdr3；
[0106]
所述f10-21轻链可变区cdr的氨基酸序列为：
[0107]
cdr1 raskdstsgysymh(seq id no.1)；
[0108]
cdr2 lvsnles(seq id no.2)；
[0109]
cdr3 qhir(seq id no.3)；
[0110]
所述f10-21重链可变区包含cdr1、cdr2、cdr3；
[0111]
所述f10-21重链可变区cdr的氨基酸序列为：
[0112]
cdr1 llie(seq id no.4)；
[0113]
cdr2 kifpergrticrensrg(seq id no.5)；
[0114]
cdr3 ggnggfvy(seq id no.6)；
[0115]
f10-21轻链氨基酸序列为：
[0116]
pilllscisgaegtisyraskdstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswk(seq id no.11)；
[0117]
f10-21重链氨基酸序列为：
[0118]
gpwpppgkflegfwlhnqylliegetqspelalagmekifpergrticrensrgrapfpantpsntpylklstltsedsavfywekgggnggfvygaqgtrapvsapkttppsaprarprpgs(seq id no.12)；
[0119]
f10-21核酸序列：
[0120]
f10-21轻链核酸序列为：
[0121]
ccgatactgctgcttagctgtatctctggggcagagggcaccatctcatacagggccagcaaagacagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaaatgaaatcctctggtggcggtggctcgggcggtggttcctctaaaatcttccaaacc(seq id no.15)；
[0122]
f10-21重链核酸序列为：
[0123]
gagggaccctggccacccccgggaaaattcctggaagggttctggctacataatcagtatttattgatagagggggaaacccagagcccggaactggcccttgcgggaatggaaaaaattttcccggaaaggggaagaacaatttgcagggaaaattccaggggaagggcccctttcccggcaaatactccctccaacacaccctacttgaaactcagcaccctgacttcggaggactctgccgtcttttactgggaaaaagggggtgggaacgggggttttgtttacggggcccagggaactcgggcccctgtctctgcacccaaaacaacccccccttctgcccctagggcccggccccggcccgggagt(seq id no.16)。
[0124]
f10-22包含f10-22轻链可变区和f10-22重链可变区；所述f10-22轻链可变区包含cdr1、cdr2、cdr3；
[0125]
所述f10-22轻链可变区cdr的氨基酸序列为：
[0126]
cdr1 rasksvstsgysymh(seq id no.7)；
[0127]
cdr2 lvsnles(seq id no.2)；
[0128]
cdr3 qhir(seq id no.3)；
[0129]
所述f10-22重链可变区包含cdr1、cdr2、cdr3；
[0130]
所述f10-22重链可变区cdr的氨基酸序列为：
[0131]
cdr1 dyplh(seq id no.8)；
[0132]
cdr2 vistyfgdsilsqkfkd(seq id no.9)；
[0133]
cdr3 rvgtt(seq id no.10)；
[0134]
f10-22轻链氨基酸序列为：
[0135]
dtcclavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswk(seq id no.13)；
[0136]
f10-22重链氨基酸序列为：
[0137]
affsgggslrsslevqlqqsgavlvrpgvsvkisckgsgytftdyplhwvkqshakslewvgvistyfgdsilsqkfkdkasvtvdksstqpiwnfqtdsedfaiyfwqervgttllgtlyfggkapl(seq id no.14)。
[0138]
f10-22核酸序列：
[0139]
f10-22轻链核酸序列：
[0140]
gatacctgctgcttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaaa(seq id no.17)；
[0141]
f10-22重链核酸序列：
[0142]
gcgtttttcagtggtggtggttcccttagatcttccctcgaggtgcagctgcagcagtctggggctgtgctggtgaggcctggggtctcagtgaagatttcctgcaagggttctggctacacattcactgattatcctctgcactgggtgaagcagagtcatgcaaagagtctagagtgggttggagttattagtacttactttggtgattctatcctcagccagaagttcaaggacaaggcctcagtgactgtagacaaatcctccacccagcctatctggaacttccagactgactctgaggatttcgccatctatttctggcaagagagggtgggaactacccttttgggtactctttacttcgggggcaaggccccttta(seq id no.18)。
[0143]
实施例4 f10-21、f10-22对pcr反应试剂稳定性的作用
[0144]
以m13 taqmen探针的pcr试剂为例，按照表3配制反应液。
[0145]
上游引物:gattctggcgtaccgttcct(seq id no.20)；
[0146]
下游引物：aacgtgctttcctcgttgga(seq id no.21)；
[0147]
探针：rox-cggcctcctgtttagctcccg-bhq2(seq id no.22)。
[0148]
表3反应液成分
[0149][0150]
以上3组反应试剂室温放置4h后按照下列程序进行pcr扩增。
[0151][0152]
实验结果如图2所示，无抗体组与含f10-21抗体组和含f10-22抗体组比较，无抗体组的荧光值明显偏低。说明无抗体组在室温放置4小时过程中，探针原料被消耗。进一步证明了f10-21、f10-22抗体有效封闭了突变型taq dna聚合酶的外切活性位点，阻止其消耗探针原料，维持了pcr反应试剂的稳定性。
[0153]
实施例5 f10-21、f10-22对野生型taq dna聚合酶外切活性位点封闭测试
[0154]
以m13 taqmen探针的pcr试剂为例：
[0155]
上游引物:gattctggcgtaccgttcct(seq id no.20)；
[0156]
下游引物：aacgtgctttcctcgttgga(seq id no.21)；
[0157]
探针：rox-cggcctcctgtttagctcccg-bhq2(seq id no.22)。
[0158]
f10-21、f10-22抗体，分别调整浓度为1.6mg/ml。按表4配制反应液：
[0159]
表4反应体系
[0160][0161]
按照下列程序收集实时荧光。
[0162][0163]
实验结果如图3所示：各实验组在48℃孵育2h后，无抗体组，荧光值明显增高，而f10-21组与f10-22组荧光值基本无变化，说明无抗体组在48℃孵育过程中，野生型taq dna聚合酶的外切功能在发挥作用，而抗体组的野生型taq dna聚合酶的外切功能则被f10-21或f10-22抗体封闭。进一步说明f10-21、f10-22抗体有封闭野生型taq dna聚合酶的外切活性位点。
[0164]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。