复合明胶冷冻凝胶细胞3D培养微载体及其大体积制备方法与流程

复合明胶冷冻凝胶细胞3d培养微载体及其大体积制备方法
技术领域：
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及复合明胶冷冻凝胶细胞3d培养微载体及其大体积制备方法。


背景技术：

2.2d细胞培养主要在聚苯乙烯或玻璃制成的2d培养皿上进行细胞培养，其生存状态并不能精确的反应细胞外基质的作用，并且不同细胞对培养介质的性质要求存在较大的差异，因此2d培养细胞在受体表达、转录、细胞迁移及凋亡等等方面均与源组织或器官存在巨大的差异；进而导致2d培养越来越难以适应现代组织工程、再生医学等对细胞大规模培养及组织生理学等方面的需求。3d细胞培养通过模拟体内微环境，增强细胞与细胞、细胞与环境之间的交流与联系，其生长形态、功能、基因表达、拓扑结构等都与体内相似，这些优势导致细胞培养技术从2d培养逐渐过渡到3d培养。
3.载体支架是细胞3d培养的重要因素之一，其主要在3d空间内构建适宜于细胞附着和生长的多孔结构，细胞依附于载体进行生长、迁移及转化。理想的载体需要具有以下特征：无毒、生物相容性好、合适的机械性能、易于被专一性降解且降解产物不会对细胞及周围组织产生危害；具有多孔结构保证细胞养分的供给及废物排出。大孔水凝胶类产品因为其生物相容性、大孔结构和与生物体组织类似的机械性能，已经被广泛的应用到细胞培养。水凝胶支架载体的机械性能和生化特性对细胞的存活、分化、附着和迁移有很大的影响。其中，机械性能包括支架刚度、粘附面的表面形貌等，主要影响细胞渗透和营养物质及废物的交换。生化特性通常是指生物相容性、维持细胞粘附和活性的能力，以及能在最小的毒性或免疫反应的情况下分解成代谢成分。因此理想的凝胶载体应具有高孔隙率、高表面积、相连的几何形等。
4.冷冻凝胶(cryogel)因为具有连贯的大孔结构，在细胞3d培养方面获得越来越多的重视。但现有大部分冷冻凝胶介质，如化学介质、多糖冷冻凝胶、蛋白冷冻凝胶等均面临营养物质或排泄废物的转运难的问题，仅仅适合实验层面的应用，且依赖外部蠕动泵等促进培养基的流动等方式严重限制了大规模、高密度细胞培养的应用效果。因此目前冷冻凝胶批量化微载体(100-200μm)制备技术是实现细胞大规模培养的重点因素。微载体支架在是细胞大规模、高密度培养方面起着关键作用，常用微载体直径一般为50-60μm。pharmacia公司生产的cytodex 3微载体在表面覆盖一层胶原蛋白显著提高了其生物相容性。因此开发生物源微载体是实现细胞大规模3d培养的关键。并且现有冷冻凝胶制备过程往往难以兼顾颗粒及整体柱的简便同时制备，难以有效同意科学研究细胞大规模培养的统一化过程，迫切需求更统一、简便的冷冻凝胶颗粒及整体柱的制备方法。而适用于细胞培养的介质主要有蛋白、多糖等，如透明质酸、明胶、海藻酸钠、壳聚糖等，这些高分子具有优良的生物相容性被广泛的应用于组织工程及细胞培养。其中明胶是一种成本低、来源广、生物相容性好、可降解的蛋白基质，明胶种的功能性氨基酸序列(包括促进细胞粘附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rdg) 序列和适于细胞重塑的基质金属蛋白酶靶序列)使其具有良好的细胞粘附
和生物相容性。但明胶蛋白结构强度较低，难以单独形成冷冻凝胶介质，往往需要化学交联，如戊二醛、碳二亚胺、二硫氰酸盐等增强其稳定性。
5.为同时提高细胞培养载体的生物相容性促进细胞的粘附效果和生长速度，并实现3d培养微载体及整体柱载体的批量化生产，目前迫切需求新型3d细胞培养介质，并开发功能化高生物相容性新型载体及其批量化生产制备工艺，以构建适应于生物医药等技术发展的新型细胞3d培养系统。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是目前迫切需求新型3d细胞培养介质，并开发功能化高生物相容性新型微载体及其批量化生产制备工艺，以构建适应于生物医药等技术发展的新型细胞 3d培养系统。
7.为解决上述问题，本发明以油相试剂构建反向包埋法，经过两次梯度乳化对明胶进行化学交联，并经过适合批量化生产系统净化方法，去除残留基团，降低细胞毒性，得到可大体积制备的复合明胶冷冻凝胶细胞3d培养微载体。
8.为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，复合明胶冷冻凝胶细胞3d培养微载体的大体积制备方法，包括以下步骤：
9.(1)制备油包水型乳化剂溶液；以油相试剂构建反向包埋方法，通过添加span 80、span 85等实现其乳化功能，用于后期分散水系蛋白样品后形成乳浊液颗粒状物质；其中乳化剂的添加是影响其粒径的因素之一，乳化剂可以促进水系蛋白溶液样品与油相(液体石蜡、正己烷等)的结合，高浓度乳化剂会提高混合速率及混合效果，导致产生较小的乳液，最终形成较小的载体颗粒。
10.(2)制备明胶溶液或明胶混合溶液：明胶按照1:25～1：40的料液比(g：ml)加入水中，加热溶解；明胶、胶原等蛋白本身存在特定的结构，更适合细胞的培养；而且蛋白浓度是影响孔径的关键因素。在冷冻凝胶形成过程中，其孔径形成主要依赖冷冻过程冰晶的形成，因此冰晶大小直观的影响了凝胶孔径的大小；在冷冻过程中，蛋白受到冰晶挤压产生空隙，高浓度蛋白会占有更大的体积导致冰晶变小进而影响颗粒孔径。此外，冷冻程序及降温速率及反复降温升温过程均会导致冰晶大小变化，进而导致孔径变化；比如快速降温冰晶较小，孔径相应减小。
11.(3)两次乳化交联；其中，当步骤(2)的明胶溶液变成透明后，添加0.3％戊二醛溶液并迅速搅拌均匀得到混合溶液；待低温恒温槽温度上升至40℃～4℃并加热均衡后，迅速将上述混合溶液加入到步骤(1)的乳化剂溶液中，进行高温下(40℃～4℃)以360rpm条件下初步乳化成乳白色溶液；待体系缓慢降温至-5～-30℃，并持续搅拌过夜，进行二次乳化交联；其中明胶等在一定温度下充分溶解变成均一的溶液状态，在应用之前应迅速加入戊二醛等交联剂，用于成颗粒过程中实现蛋白等的交联、固化，如果未初始乳化样品会出现成块现象，样品产率很低，这是因为明胶样品成颗粒主要依赖于反向包埋法，其基本原理在于水系蛋白溶液在有机体系中通过机械搅拌乳化产生微小乳液液滴，进而在低温下冷冻乳化聚合；如果没有经过初始乳化过程，水系样品仍旧均一分散，在低温条件下会导致大规模不规则冷冻聚合，进而导致颗粒产生较少。初次乳化时有机相初始温度可以从40℃到4℃，其决定了样品蛋白乳化的效果，这是因为明胶蛋白因为其来源导致具备不同的特征，其水溶液
在一定浓度之下会随温度下降自动产生凝胶化，严重影响了样品的混合乳化效果；为充分实现样品乳化其基本要求为蛋白溶液保持溶液流动状态，因此保持一定温度确保凝胶溶液不自动凝胶话对乳化效果影响较大；此外，高温会促进戊二醛等的交联反应，交联之后的蛋白溶液引分子间强度增大甚至呈现凝胶特性往往会限制乳化效果，因此需要根据实际样品综合平衡乳化温度，提高其效果，在这期间蛋白样品在有机体系中迅速形成乳浊液颗粒；随后有机体系温度下降至-5到-30℃等温度，将水系样品冷冻，冷冻的水系成为冷冻凝胶的冰晶，冷冻过程戊二醛进行二次乳化交联。初始乳化时的温度及转速决定了明胶颗粒的孔径和大小，这是因为明胶颗粒的形成主要依赖反相包埋过程中蛋白溶液乳液液滴的形成，高转速会降低乳液液滴的体积进而导致最终的颗粒较小；初始温度较高时冷冻降温速率较慢，会使凝胶内部冰晶形成缓慢，体积增大，进而导致最后凝胶颗粒的孔径较大，二次乳化时的降温速率及最低温度则主要影响孔径大小，这是因为降温速率及最低温度影响了样品液滴中冰晶颗粒的大小，降温速率较慢、最低温度偏高时冰晶形成速率较慢，冰晶较大，进而导致微粒中形成的空隙较大，造成较大的孔径；反之亦然。
12.(4)去除杂质：样品经清洗、过筛后，用硼氢化钠还原，随后用去离子水冲洗。制备的明胶颗粒含有大量残留基团，主要是戊二醛基团，用硼氢化钠还原之后可以有效去除残留集团，降低细胞毒性。
13.进一步的，步骤(1)所述油包水型乳化剂溶液的乳化剂为span 80和/或span 85，溶剂为正己烷、环己烷、液体石蜡、食用油中的一种或一种以上混合物。
14.进一步的，步骤(2)在37℃条件下加热溶解。
15.进一步的，步骤(3)为明胶溶液或明胶与水溶性及盐溶性蛋白样品的混合溶液或明胶与壳寡糖、葡聚糖及海藻酸钠的混合溶液。
16.进一步的，步骤(4)将筛分完毕的凝胶颗粒分散在1％硼氢化钠溶液中，并于室温下搅拌2h直到样品变成白色，随后凝胶用去离子水充分冲洗去除残留杂质。
17.进一步的，所述制备方法还包括细胞3d培养载体的净化方法，包括以下步骤：
18.(5-1)将步骤(4)制备的细胞3d培养载体依次用80％，60％，40％，20％的乙醇水溶液分散后机械搅拌30min，随后超声12min；上述净化过程重复4遍。最后用灭菌水配置75％乙醇水溶液密封保存；梯度乙醇结合超声清洗用于去除3d微载体空隙中残留的有机试剂，降低细胞毒性；同时兼具杀灭细菌等功能。
19.(5-2)梯度净化3d微载体用无菌水冲洗5遍，随后无菌条件下冻干保存；净化后样品冻干保存可以有效提升产品质量和保质期。
20.(5-3)梯度净化样品用无菌水冲洗5遍后121℃高压灭菌处理保存。明胶颗粒耐受高温高压，可以采用高温高压灭菌的方法去除明胶残留细菌等杂质，更有利于后期细胞培养。
21.实验证明如图6所示，未经过净化之后的微载体具有明显的细胞毒性，细胞经培养之后并pi(溴化乙锭)染色发现超过1/3的细胞会因为明胶颗粒的细胞毒性死亡。
22.一种上述方法制备的复合明胶冷冻凝胶细胞3d培养微载体，相比于传统凝胶颗粒制备局限于小体系，该方法可以通过等比例放大制备大体系凝胶样品，通过调节转速等控制条件可以将凝胶批次制备体积提升到10l以上。
23.本发明的有益效果在于：针对细胞3d培养微载体制备领域的局限，本发明利用反
相包埋法二次乳化程序构建了大体系细胞3d培养微载体的制备方法，该方法简便、高效，可以根据实际需求调节制备体系并可以兼顾制备整体柱及凝胶颗粒；形成的3d微载体含有大体积微孔结构，孔隙率大于80％，粒径可以根据需求进行调节；脱毒措施可以有效快速去除微载体的细胞毒性，实现细胞的高效培养；该方法基本构建细胞3d微载体的批量化生产方法。
附图说明
24.图1：明胶3d微载体冻干粉(a)及75％乙醇分散样品(b)。
25.图2：明胶3d微载体扫描电镜(sem)图。
26.图3：不同批次明胶3d微载体显微镜及粒径分布图。
27.图4：明胶3d冷冻凝胶微载体sem图。
28.图5：3d微载体培养草金鱼肌肉干细胞效果图。
29.图6：未经过脱除处理3d冷冻凝胶微载体细胞培养效果。
具体实施方式：
30.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1：36g span 80(或span 85及其它油包水型乳化剂)于2l圆底烧瓶中充分溶解在600ml正己烷(环己烷、液体石蜡、食用油等)中，高速搅拌至充分溶解；随后圆底烧瓶放置在低温恒温槽中持续搅拌均匀。6g动物明胶分散在150ml去离子水中，随后在45℃条件下加热溶解；待样品变成透明溶液后，溶液添加0.3％戊二醛溶液(戊二醛终浓度在 0.1％-0.6％之间)并迅速搅拌均匀。待低温恒温槽温度上升至35℃时，迅速将明胶溶液样品加入到正己烷油相中并继续搅拌(转速280-450rpm)1min左右初次乳化形成乳白色溶液后，体系缓慢降温至-20℃，并持续搅拌6h(对环己烷因为其凝固点较高，待溶液凝固后停止搅拌)，随后冷冻过夜。
32.制备完毕的样品经过无水乙醇、乙醇水溶液及去离子水充分清洗去除残留液体石蜡及其他杂质，随后样品经过筛网湿法筛分。筛分完毕的凝胶颗粒分散在1％硼氢化钠溶液中，并于室温下搅拌2h直到样品变成白色，随后凝胶用去离子水充分冲洗去除残留杂质后备用。
33.实施例2：36g span 80于2l圆底烧瓶中充分溶解在600ml正己烷(环己烷、液体石蜡、食用油)中，高速搅拌至充分溶解；4g动物明胶及2g透明质酸(所有水溶性及盐溶性蛋白样品都可)分散在150ml去离子水中，随后在37℃条件下加热溶解；待样品变成透明溶液后，溶液添加0.3％戊二醛溶液并迅速搅拌均匀。待低温恒温槽温度上升至35℃并加热均衡后，迅速将明胶溶液样品加入到油相并继续搅拌(转速360rpm)1min左右形成初次乳化乳白色溶液，体系随后缓慢降温至-12℃，并持续搅拌过夜。
34.制备完毕的样品经过无水乙醇、乙醇水溶液及去离子水充分清洗去除残留液体石蜡及其他杂质，随后样品经过筛网湿法筛分。筛分完毕的凝胶颗粒分散在1％硼氢化钠溶液
中，并于室温下搅拌2h直到样品变成白色，随后凝胶用去离子水充分冲洗去除残留杂质后备用。
35.实施例3：36g span 80于2l圆底烧瓶中充分溶解在600ml正己烷(环己烷、液体石蜡、食用油)中，高速搅拌至充分溶解；随后圆底烧瓶放置在低温恒温槽中持续搅拌均匀。4 g动物明胶及2g壳聚糖(壳寡糖、葡聚糖及海藻酸钠等大分子多糖)分散在150ml去离子水中，随后在40℃条件下加热溶解；待样品变成透明溶液后，溶液添加0.3％戊二醛溶液并迅速搅拌均匀。待低温恒温槽温度上升至35℃并加热均衡后，迅速将明胶溶液样品加入到油相中并继续搅拌(转速380rpm)1min左右形成初次乳白色溶液，体系随后缓慢降温至-12℃，并持续搅拌过夜。
36.制备完毕的样品经过无水乙醇、乙醇水溶液及去离子水充分清洗去除残留液体石蜡及其他杂质，随后样品经过筛网湿法筛分。筛分完毕的凝胶颗粒分散在1％硼氢化钠溶液中，并于室温下搅拌2h直到样品变成白色，随后凝胶用去离子水充分冲洗去除残留杂质后备用。
37.实施例4：
38.细胞3d培养载体净化方法，包括以下步骤：
39.(1)制备的3d微载体用80％，60％，40％，20％的乙醇水溶液分散后机械搅拌30min，随后超声12min；上述净化过程重复4遍。最后用灭菌水配置75％乙醇水溶液密封保存；
40.(2)梯度净化3d微载体用无菌水冲洗5遍，随后无菌条件下冻干保存；
41.(3)梯度净化样品用无菌水冲洗5遍后121℃高压灭菌处理保存。
42.其余均与实施例1-3任一相同。
43.用上述方法制备的复合明胶冷冻凝胶细胞3d培养微载体，如图1所示，制备的凝胶颗粒可以通过75％乙醇保存形成稳定的凝胶分散样品，也可以通过冻干保存，产品为均匀的颗粒状分散物。如图2所示，所述明胶3d微载体表面呈现多孔结构，经过计算其孔隙率大于 85％。如图3所示，所述明胶3d微载体呈现较为均匀的圆形，均一性良好，改变制备条件明胶颗粒粒径分布在90-180μm之间，普遍分布在130-160μm，满足细胞培养的微载体体积条件。如图4所示，明胶冷冻凝胶内部呈现均一的大孔结构，平均孔径大于40μm；该孔径可以实现细胞的黏附、生长，并可以有效的实现营养物质和废物的排出。
44.细胞培养实验
45.将实施例4的3d微载体0.01g转入50ml培养基，在37℃条件下以转速35rpm预培养 30min使3d微载体充分适应培养基环境，随后将草金鱼肌肉干细胞接种入瓶，接入细胞后以 30rpm搅拌5min使充分混匀，随后保持温度37℃，转速35-45rpm转动。培养1，3，5 天分别用calcein染色剂标记细胞并进行荧光观察。结果如图5所示，草金鱼肌肉干细胞在制备3d微载体上可以进行迅速繁殖，随着时间的增长，从1天到5天培养过程中，活细胞的密度大幅度增长(钙黄绿色染色效果，明亮处为细胞增殖区域)，表明该凝胶可以有效促进细胞的增殖；且在细胞繁殖过程中微载体没有出现明显的团聚、裂解等现象。