一种基于多重荧光定量PCR检测技术的牛呼吸道病毒检测方法

一种基于多重荧光定量pcr检测技术的牛呼吸道病毒检测方法
技术领域
1.本发明涉及农业、畜牧业、动物防疫控制方面技术领域，具体为一种基于多重荧光定量pcr检测技术的牛呼吸道病毒检测方法。


背景技术：

[0002][0003]
现有的牛呼吸道综合征的检测方法有血清学方法以及分子生物学方法等，对牛分枝杆菌、牛支原体、牛肺炎克雷伯菌的检测方法多采用涂片镜检和细菌分离鉴定等细菌学检查方法及常规的免疫学方法，存在灵敏度和准确度较低，耗时较长等问题。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供一种基于多重荧光定量pcr检测技术的牛呼吸道病毒检测方法，具备了建立的多重荧光定量pcr检测技术能够同时检测样品中的牛呼吸道病毒(牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛流行热病毒和牛疱疹病毒4型)，实现牛呼吸道疾病的快速诊断和高通量诊断，且操作简单，减少样本间污染几率，提高我国牛病的检测水平效果，解决了现有的牛呼吸道综合征的检测方法有血清学方法以及分子生物学方法等，对牛分枝杆菌、牛支原体、牛肺炎克雷伯菌的检测方法多采用涂片镜检和细菌分离鉴定等细菌学检查方法及常规的免疫学方法，存在灵敏度和准确度较低，耗时较长等问题的问题。
[0005]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于多重荧光定量pcr 检测技术的牛呼吸道病毒检测方法，包括以下几个步骤：
[0006]
s1、将bhv1病毒和mb的dna的提取；
[0007]
s2、用抗原捕获elisa检测brsv的核蛋白(np)抗原；
[0008]
s3、bvdv、brsv、bpiv3和bcov病毒rna的提取以及反转录；
[0009]
s4、随后用聚合酶链反应(pcr)扩大brsv的融合蛋白质；
[0010]
s5、用显微镜分离分析结合免疫过氧化物酶染色检测brsv的f蛋白质；
[0011]
s6、提取的核酸适配体分别进行一轮对称pcr和一轮非对称pcr；
[0012]
s7、特异性引物进行pcr反应条件优化，建立最佳多重pcr反应体系，进行多重pcr重复性性验证。
[0013]
可选的，所述s1中，bhv1病毒和mb的dna的提取方法为：取适量bhv1 病毒和mb液，置于2ml eppendorf管中，然后提取dna，将提取的基因组dna 置于-25℃保存备用。
[0014]
可选的，所述s2中，用抗原捕获elisa检测，将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。
[0015]
可选的，所述s3中，提取bvdv、brsv、bpiv3和bcov病毒液，然后提取病毒rna，将提取的病毒rna反转录成cdna，将反转录的cdna置于-25℃保存备用。
[0016]
可选的，所述s4中，用特异性细胞因子引物经聚合酶链反应(pcr)扩增细胞因子cdna,southern blot后用标记探针检测特异细胞因子dna水平。
[0017]
可选的，所述s5中、荧光抗体染色标本不能长期保存，需用荧光显微镜观察，直接涂片染色镜检直接涂片染色镜检法可在显微镜下直接观察分离分析结合免疫过氧化物酶染色检测brsv的f蛋白质的形态、大小、排列方式和染色特点。
[0018]
可选的，所述s6中，对称pcr具体为：2
×
mix 25μl，wz-02 1μl，wz-04 1μl，适配体3μl，去离子水20μl，反应条件为90℃、12min，90℃、25s， 70℃、15s，75℃、28s，15个循环，70℃、8min；非对称pcr具体为2
×
mix 25μl，wz-02 1μl，wz-04 0.02μl，适配体5μl，去离子水19μl，反应条件为90℃、12min，90℃、15s，60℃、30s，70℃、25s，25个循环，70℃、 8min。
[0019]
可选的，所述s7中，最佳多重pcr条件具体为：50μl反应体系中6对引物上下游混合引物6μl，dna/cdna混合模板4μl，金牌(green)补足50μ l；多重pcr反应条件为：95℃5min；95℃45min，53℃45s，70℃30s，32个循环；70℃20min。
[0020]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0021]
建立的多重荧光定量pcr检测技术能够同时检测样品中的牛呼吸道病毒 (牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛流行热病毒和牛疱疹病毒4型)，实现牛呼吸道疾病的快速诊断和高通量诊断，且操作简单，减少样本间污染几率，提高我国牛病的检测水平。
附图说明
[0022]
图1为一种基于多重荧光定量pcr检测技术的牛呼吸道病毒检测方法的流程图。
具体实施方式
[0023]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0024]
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种基于多重荧光定量pcr检测技术的牛呼吸道病毒检测方法，包括以下几个步骤：
[0025]
s1、将bhv1病毒和mb的dna的提取；
[0026]
s2、用抗原捕获elisa检测brsv的核蛋白(np)抗原；
[0027]
s3、bvdv、brsv、bpiv3和bcov病毒rna的提取以及反转录；
[0028]
s4、随后用聚合酶链反应(pcr)扩大brsv的融合蛋白质；
[0029]
s5、用显微镜分离分析结合免疫过氧化物酶染色检测brsv的f蛋白质；
[0030]
s6、提取的核酸适配体分别进行一轮对称pcr和一轮非对称pcr；
[0031]
s7、特异性引物进行pcr反应条件优化，建立最佳多重pcr反应体系，进行多重pcr重复性性验证。
[0032]
s1中，bhv1病毒和mb的dna的提取方法为：取适量bhv1病毒和mb液，置于2ml eppendorf管中，然后提取dna，将提取的基因组dna置于-25℃保存备用，取bhv1病毒和支原体dna的菌液150μl到离心管(2ml)中，分别加 25μl ob protease混合均匀后，于70℃水浴
锅中水浴10min，期间进行震摇使之充分反应。
[0033]
s2中，用抗原捕获elisa检测，将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法，抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，原因是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗体反应等免疫活性，抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点，酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或者抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。
[0034]
s3中，提取bvdv、brsv、bpiv3和bcov病毒液，然后提取病毒rna，将提取的病毒rna反转录成cdna，将反转录的cdna置于-25℃保存备用，转移20μl proteinase k至2ml离心管中；转移200μl样品，如唾液、肺部分泌物、培养液上清、或其它无细胞体液至装有proteinase k的离心管中，振荡混匀7s，若样品不足200μl，用bufferpbs或nuclease free water补足，固体组织样品先用buffer pbs浸泡或匀浆后，离心取上清进行操作。
[0035]
s4中，用特异性细胞因子引物经聚合酶链反应(pcr)扩增细胞因子 cdna,southern blot后用标记探针检测特异细胞因子dna水平，在lcr中，一对寡核苷酸探针杂交到靶dna的相邻序列上，之间形成的缺口被连接酶所连接，再由连接产物的引物进行温度循环扩增，此方法的最大优点就是可用检测基因突变，具有与pcr一致的检测灵敏度，靶核酸被杂交捕获后，等位基因特异性的探针被连接到一荧光标记的探针，等位基因特异的探针在5'端有一段外加序列用来捕获dna微阵列上的lcr产物，从而对带有荧光的产物进行测定，结合了液相lcr的特异性与通用型阵列的多重性。
[0036]
s5中，荧光抗体染色标本不能长期保存，需用荧光显微镜观察，直接涂片染色镜检直接涂片染色镜检法可在显微镜下直接观察分离分析结合免疫过氧化物酶染色检测brsv的f蛋白质的形态、大小、排列方式和染色特点，凡在形态和染色性上具有特征的致病菌，直接涂片染色后镜检有助于初步诊断，可在直接涂片后，以特异性荧光抗体染色，在荧光显微镜下观察，若出现有发荧光的菌体就是欲检验的细菌。
[0037]
s6中，对称pcr具体为：2
×
mix 25μl，wz-02 1μl，wz-04 1μl，适配体3μl，去离子水20μl，反应条件为90℃、12min，90℃、25s，70℃、 15s，75℃、28s，15个循环，70℃、8min；非对称pcr具体为2
×
mix 25μl， wz-02 1μl，wz-04 0.02μl，适配体5μl，去离子水19μl，反应条件为90℃、 12min，90℃、15s，60℃、30s，70℃、25s，25个循环，70℃、8min，用bioteke 短片段dna胶回收试剂盒按照说明书要求回收pcr产物，随后进行反筛，即微孔板包被g蛋白的同时包被无g蛋白的包被液反筛孔，同样条件封闭后，将非对称pcr回收的核酸适配体加入反筛孔，37℃孵育30min后将上清吸出，加入包被有g蛋白的微孔中孵育1.5h。
[0038]
s7中，最佳多重pcr条件具体为：50μl反应体系中6对引物上下游混合引物6μl，dna/cdna混合模板4μl，金牌(green)补足50μl；多重pcr 反应条件为：95℃5min；95℃45min，53℃45s，70℃30s，32个循环；70℃20min，分别以prv、大肠杆菌(e.coli)、bvdv、bpiv3、brsv、bcov、mb和bhv1基因组为模板，同时以ddh2o为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和体系在相同条件下进行pcr反应，多重pcr扩增后，产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可见bvdv、bpiv3、brsv、bcov、mb和bhv1分别扩增出139bp、239bp、 304bp、456bp、527和798bp，与预期目的条带相符，6对引物对双蒸水、大肠杆菌(e.coli)、prv均未出现任何扩增
条带，结果显示与预期结果相一致，可见，多重pcr的特异性验证试验证实了这6对引物具有很强的特异性。
[0039]
工作原理：该一种基于多重荧光定量pcr检测技术的牛呼吸道病毒检测方法，首先将bhv1病毒和mb的dna的提取，随后用抗原捕获elisa检测brsv 的核蛋白(np)抗原，利用bvdv、brsv、bpiv3和bcov病毒rna的提取以及反转录，随后用聚合酶链反应(pcr)扩大brsv的融合蛋白质，用显微镜分离分析结合免疫过氧化物酶染色检测brsv的f蛋白质，提取的核酸适配体分别进行一轮对称pcr和一轮非对称pcr，特异性引物进行pcr反应条件优化，建立最佳多重pcr反应体系，进行多重pcr重复性性验证，建立的多重荧光定量pcr检测技术能够同时检测样品中的牛呼吸道病毒(牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛流行热病毒和牛疱疹病毒4型)，实现牛呼吸道疾病的快速诊断和高通量诊断，且操作简单，减少样本间污染几率，提高我国牛病的检测水平。
[0040]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。