靶向HER2和PD-L1的双特异性抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向her2和pd-l1的双特异性抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,her2)隶属表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，egfr)蛋白家族，可通过与egfr家族其他成员的异源二聚化或由于其自身的过表达所引起的同源二聚化，使胞质结构域上的酪氨酸残基发生自磷酸化并起始细胞增殖和肿瘤发生的一系列信号途径(oh,d.y.and y.j.bang.(2020)."her2-targeted therapies-a role beyond breastcancer."nat rev clin oncol 17(1):33-48.)。her2仅在极少数正常组织中低水平表达。但研究表明，her2在乳腺癌、胃癌、卵巢癌和子宫内膜癌等癌症类型中过表达，且其过表达与肿瘤恶性程度和不良预后相关(normanno,n.,et al.(2005)."the erbb receptors andtheir ligands in cancer:an overview."curr drug targets 6(3):243-257.)。基于her2的表达特性和在肿瘤发生发展中的生物学功能，其已成为经过广泛验证的肿瘤治疗靶点，多个靶向her2的单克隆抗体药物已获批上市。然而，仅有不到30％的病人对其产生应答，而且大部分初始应答的患者会在一年内产生治疗耐受或复发(gu,c.l.,et al.(2021)."bispecific antibody simultaneously targeting pd1 and her2 inhibitstumor growth via direct tumor cell killing in combination with pd1/pdl1blockade and her2 inhibition."acta pharmacol sin.)。

2、pd-l1为免疫球蛋白超家族成员，是i型跨膜糖蛋白，表达于巨噬细胞、某些激活的t细胞和b细胞、dcs和某些上皮细胞(sharpe,a.h.,et al.(2007)."the function ofprogrammed cell death 1and its ligands in regulating autoimmunity andinfection."nat immunol 8(3):239-245.)。此外，pd-l1也被肿瘤细胞高表达以逃逸适应性抗肿瘤免疫应答(ohaegbulam,k.c.,et al.(2015)."human cancer immunotherapywith antibodies to the pd-1and pd-l1 pathway."trends mol med 21(1):24-33.)。在肿瘤微环境中，pd-l1的表达上调通过pd-1信号通路可直接抑制t细胞的抗肿瘤反应，介导肿瘤细胞的免疫逃逸。近年来，针对pd-1/pd-l1信号途径的阻断型抗体药物开发吸引了广泛的关注，多个靶向pd-1或pd-l1的单克隆抗体药物已获批上市并且在临床上取得了令人振奋的疗效。尽管如此，大部分患者对pd-1/pd-l1阻断的免疫治疗未产生应答，而且部分初始应答的患者也产生了治疗耐受。

3、双特异性抗体是可以同时结合两个抗原或同一抗原的不同表位的重组抗体，不仅可以将免疫效应细胞重定向至肿瘤组织以实现免疫细胞对肿瘤的特异性杀伤，而且能够同时抑制同一肿瘤细胞上的不同促肿瘤信号途径进而发挥协同抑瘤功能(labrijn,a.f.,etal.(2019)."bispecific antibodies:amechanistic review of the pipeline."nat revdrug discov 18(8):585-608.)。因此，为了提高her2阳性肿瘤的治疗应答率并克服肿瘤治疗耐受，亟需开发靶向her2和pd-l1的双特异性抗体。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种靶向her2和pd-l1的双特异性抗体及其制备方法和应用。本发明的双特异性抗体的理化性质较佳，具有较好的纯度和热稳定性；能够保留针对双靶点的功能活性，对两个靶点的结合活性均与其相对应的单抗接近(即结合pd-l1又结合her2且与单独单抗结合能力相当或更佳)，阻断pd-1/pd-l1的活性与对应的单抗相当，且抑制sk-br-3细胞增殖活性与对应的单抗相当；同时表现出很好的adcc活性，显著优于其对应的单抗。

2、本发明一方面提供一种双特异性抗体，其包含靶向her2的第一蛋白功能区和靶向pd-l1的第二蛋白功能区；其中，所述第一蛋白功能区包含轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)，且所述vl包含如seq id no:3所示序列中所含的三个互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述vh包含如seq id no:4所示序列中所含的三个互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3；

3、所述第二蛋白功能区包含vhh，其中，所述vhh包含如seq id no:2所示序列中所含的三个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3。

4、在某一较佳实施方案中，所述vl包含如seq id no:3所示序列，或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列；且所述vh包含如seq id no:4所示序列，或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

5、在某一较佳实施方案中，所述vhh包含如seq id no:2所示序列，或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。

6、在如上所述的双特异性抗体，所述第一蛋白功能区较佳地包含fab；

7、其中，所述fab与所述vhh可操作地连接，例如所述vhh连接于所述fab中轻链可变区的n端、或重链可变区的n端、或轻链恒定区的c端，或者所述fab与所述vhh分别可操作地连接于fc区的两个铰链区的n端。

8、在如上所述的双特异性抗体，所述第一蛋白功能区较佳地为igg，在某一优选实施方案中，所述vhh可操作地连接于所述igg重链恒定区的c端。

9、如上所述的双特异性抗体较佳地含有两条第一多肽链和两条第二多肽链。

10、在某一较佳实施方案中，

11、所述第一多肽链如下式所示：

12、vh-ch1-铰链区-ch2-ch3，优选包含如seq id no:9所示的序列，

13、且所述第二多肽链如下式所示：

14、vhh-连接子-vl-cl，优选包含如seq id no:10所示的序列。

15、在某一较佳实施方案中，

16、所述第一多肽链如下式所示：

17、vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-连接子-vhh，优选包含如seq id no:6所示的序列，

18、且所述第二多肽链如下式所示：

19、vl-cl，优选包含如seq id no:7所示的序列。

20、在某一较佳实施方案中，

21、所述第一多肽链如下式所示：

22、vhh-连接子-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3，优选包含如seq id no:8所示的序列，

23、且所述第二多肽链如下式所示：

24、vl-cl，优选包含如seq id no:7所示的序列。

25、在某一较佳实施方案中，

26、所述第一多肽链如下式所示：

27、vh-ch1-铰链区-ch2-ch3，优选包含如seq id no:9所示的序列，

28、且所述第二多肽链如下式所示：

29、vl-cl-连接子-vhh，优选包含如seq id no:11所示的序列。

30、如上所述的双特异性抗体较佳地含有第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，其中，所述第一多肽链如下式所示：

31、vhh-铰链区-ch2-ch3；

32、所述第二多肽链如下式所示：

33、vh-ch1-铰链区-ch2-ch3；

34、所述第三多肽链如下式所示：

35、vl-cl。

36、在某一较佳实施方案中，所述第一多肽链包含如seq id no:12所示的序列，且所述第二多肽链包含如seq id no:13所示的序列，且所述第三多肽链包含如seq id no:7所示的序列。

37、在某一较佳实施方案中，所述第一多肽链包含如seq id no:14所示的序列，且所述第二多肽链包含如seq id no:15所示的序列，且所述第三多肽链包含如seq id no:7所示的序列。

38、本发明还提供一种分离的核酸，其编码如本发明所述的双特异性抗体。

39、本发明还提供一种包含如本发明所述的分离核酸的重组表达载体。

40、本发明还提供一种转化体，其包含如本发明所述的分离的核酸或如本发明所述的重组表达载体。

41、如上所述的转化体，所述转化体的宿主细胞较佳地为原核细胞或真核细胞，所述原核细胞优选e.coli细胞如tg1、bl21，所述真核细胞优选hek293细胞或cho细胞。

42、一旦已经制备了用于表达的表达载体或dna序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将dna掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的dna序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mrna。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

43、本发明还提供一种双特异性抗体的制备方法，其包含培养如本发明所述的转化体，从培养物中获得双特异性抗体。

44、本发明还提供一种药物组合物，其包含如本发明所述的双特异性抗体，以及药学上可接受的载体。

45、在某一较佳实施方案中，所述药物组合物还包括其他抗肿瘤抗体作为活性成分、和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。

46、在一些实施方案中，本发明的药物组合物或药物制剂包含合适的药学上可接受的载体例如药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。如本发明所用，“药学上可接受的载体”或“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“handbook of pharmaceutical excipients”，第五版，r.c.rowe、p.j.seskey和s.c.owen，pharmaceutical press，london，chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体或其抗原结合片段与一种或多种任选的药用辅料(remington’spharmaceutical sciences，第16版，osol，a.编(1980))混合来制备包含本发明所述的药物制剂或药物组合物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗感染活性成分，例如其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的抗体或其抗原结合片段的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

47、本发明还提供一种抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂或标签，以及本发明所述的双特异性抗体；所述细胞毒性剂较佳地为mmaf或mmae；所述标签较佳地为荧光剂。

48、本发明还提供一种试剂盒，其包括如本发明所述的双特异性抗体、如本发明所述的药物组合物、或如本发明所述的抗体药物偶联物。

49、所述试剂盒较佳地还包括(i)施用双特异性抗体或抗体药物偶联物或药物组合物的装置；和/或(ii)使用说明。

50、本发明还提供一种套装药盒，其包含药盒a和药盒b，其中：

51、所述药盒a含有如本发明所述的双特异性抗体、如本发明所述的药物组合物、或如本发明所述的抗体药物偶联物。

52、所述药盒b含有其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。

53、本发明还提供一种检测特异性抗原的非诊断目的的方法，其包括使用本发明所述的双特异性抗体进行检测。

54、所述非诊断目的的应用场景可为本领域常规，例如如在实验室中检测抗原或者研究抗体的竞争结合。

55、本发明还提供一种如本发明所述的双特异性抗体、如本发明所述的核酸、如本发明所述的重组表达载体、如本发明所述的转化体、如本发明所述的药物组合物、如本发明所述的抗体药物偶联物、如本发明所述的试剂盒或如本发明所述的套装药盒在制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

56、所述肿瘤较佳地为与her2和/或pd-l1有关的肿瘤。

57、所述肿瘤例如乳腺癌、胃癌、骨肉瘤、促纤维增生性小圆细胞癌、头颈癌的鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、多形性胶质母细胞瘤、胃结合部腺癌、胃食管结合部腺癌、宫颈癌、唾液腺癌、软组织肉瘤、白血病、黑素瘤、尤文氏肉瘤、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤、或小细胞肺癌。

58、本发明还提供一种诊断、治疗和/或预防her2和/或pd-l1介导的肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如本发明所述的双特异性抗体、如本发明所述的核酸、如本发明所述的重组表达载体、如本发明所述的转化体、如本发明所述的药物组合物或如本发明所述的抗体药物偶联物治疗有需要的患者。

59、所述肿瘤较佳地为乳腺癌、胃癌、骨肉瘤、促纤维增生性小圆细胞癌、头颈癌的鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、多形性胶质母细胞瘤、胃结合部腺癌、胃食管结合部腺癌、宫颈癌、唾液腺癌、软组织肉瘤、白血病、黑素瘤、尤文氏肉瘤、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤或小细胞肺癌。

60、本发明提供的双特异性抗体相比单一疗法，靶向her2和pd-l1的双特异性抗体具有多重优势：一方面，可以协同发挥adcc和pd-1/pd-l1双重抗肿瘤活性，提高肿瘤治疗效果；另一方面，可以提高肿瘤治疗的靶向性，减少对her2或pd-l1阳性正常组织的毒副作用。

61、本发明的积极进步效果在于：本发明的双特异性抗体的理化性质较佳，具有较好的纯度和热稳定性；能够保留针对双靶点的功能活性，对两个靶点的结合活性均与其相对应的单抗接近(即结合pd-l1又结合her2且与单独单抗结合能力相当或更佳)，阻断pd-1/pd-l1的活性与对应的单抗相当，且抑制sk-br-3细胞增殖活性与对应的单抗相当；同时表现出很好的adcc活性和体内抑瘤活性。